中文
免疫系統對外來和自身抗原的區分不是絕對的，在某些情況下，機體免疫系統功能的異常，會導致機體攻擊自身組織，這類疾病被稱為“自身免疫性疾病（autoimmune diseases，AIDs）”。AIDs在人群中的發病率極高，約7~9% [1]。目前已確定的81種AIDs[2]，根據組織受損的程度被分為：（1）器官特異性疾病，如I型糖尿病（T1DM）、多發性硬化癥（MS）、炎癥性腸病（IBD）和重癥肌無力（MG）等；（2）全身性疾病，如系統性紅斑狼瘡（SLE）、類風濕性關節炎（RA）和Sj?gren綜合征（SS）等。
免疫系統攻擊自身組織，主要由T和B淋巴細胞參與，這一過程被認為會促進疾病的進展。先前的研究表明，多種AIDs患者體內都存在TCR異常表達。此外，在一些AIDs中發現了TCR庫的變化，這可能是因為外周免疫耐受遭到了破壞。正常情況下，TCR是隨機重排的，CDR3長度的分布大致為高斯分布[3]。然而，在一些AIDs中，TCR和疾病特異性CDR3克隆型的分布存在偏倚，這可能與自身抗原暴露和表位擴增有關。因此，TCR庫測序提供了研究免疫疾病的新策略，尤其是疾病特異性的主克隆可以作為生物標志物或免疫治療的潛在靶標，并幫助醫生監測患者對治療干預的反應。目前TCR庫的研究已在多種AIDs中進行，本文將以系統性紅斑狼瘡（SLE）、類風濕性關節炎（RA）、I型糖尿病（T1DM）這三類AIDs為例，簡單介紹TCR庫在疾病中的作用。
PART 01
系統性紅斑狼瘡（SLE）
系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種累及多系統的慢性炎癥性疾病，主要發生于年輕女性。常見表現可包括多關節痛和關節炎、雷諾綜合征、面頰及其他部位皮疹、胸膜炎或心包炎、腎臟或中樞神經系統受累以及自身免疫性細胞減少。臨床上對SLE患者的TCR庫變化進行了廣泛的研究（表1）[3]。
表1 關于系統性紅斑狼瘡TCR庫的研究[3]
Thapa等在一項研究中利用NGS來評估11例SLE患者外周血中TCR庫多樣性的變化是否與疾病狀態相關，或是否能預測其變化[4]。每個受試者有三個樣本，分別在疾病的臨床靜止期和爆發期收集。同時選取12名年齡匹配的健康志愿者（HC）作為對照。結果如圖1所示，與健康人相比，SLE患者（處于靜止狀態）的TCR庫多樣性減少了2.2倍（P<0.0002），tcr庫分布更不均勻（gini系數，hc vs="" p="0.015），TCR庫中擴增克隆的百分比有增加趨勢（克隆大小">1.0%，HC vs SLE, P = 0.078）。但是，在大多數SLE患者中，未觀察到總體的TCR庫多樣性與臨床疾病活動之間有顯著相關性（圖2）。因此，在不知道SLE特異性克隆的情況下，監測SLE患者外周血中的TCR庫可能無法準確預測疾病活動狀態的變化。
圖1 健康對照（HC）和系統性紅斑狼瘡（SLE）患者TCR庫分析[4]
注：A，通過測量每標準化血體積的克隆型數量得到的TCR庫多樣性，HC vs SLE（Mann-Whitney檢驗）；B，克隆型分布的均勻性，使用Gini系數，HC vs SLE（Mann-Whitney檢驗）
圖2 SLE患者TCR庫的縱向分析[4]
注：前50個無性系克隆型的頻率及相對排名。SLE患者的三個采樣時間點分別為靜止（Q）、爆發前（PF）和爆發（F）。從第一個樣本開始計算的時間（月）。水平紅線以上的克隆（>1%）表示高度擴增克隆（HEC）
然而，另一些研究卻得出截然不同的結果。例如，Luo等人[5]為了尋找特異性TCR α和β鏈的保守基序，并分析CDR3譜型與SLE疾病活動狀態之間的關系，分析20例SLE患者的TCR α和β鏈CDR3的譜型，結果表明CDR3譜型隨SLE疾病活動狀態的變化而呈現動態變化趨勢（圖3）。
圖3 局部分析SLE患者LYJ和LSB在治療前后TCR AV和BV家族的使用變化，以及患者LYS在4個疾病階段的所有BV家族特征
PART 02
類風濕性關節炎（RA）
類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種主要累及關節的慢性系統性自身免疫性疾病，由細胞因子、趨化因子和金屬蛋白酶介導。對稱性外周關節炎（如腕關節和掌指關節）是類風濕關節炎的主要特征，受累關節結構進行性破壞，并常伴有全身癥狀。科學家們在探索RA患者的TCR庫多樣性方面做出了巨大的努力（表2）。
表2 關于類風濕性關節炎（RA）TCR庫的研究[3]
Jiang等人在一項研究[6]中將來自未經治療的RA患者和健康志愿者的外周CD4+ T細胞分成7個亞群（na?ve、效應、中樞記憶、效應記憶（EMT）、Th1、Th17和調節性T細胞），然后通過NGS分析TCR β鏈的譜型，結果顯示（圖4和圖5），相比于健康志愿者，在RA患者的EMT和Th17細胞中發現了更少的TCR庫多樣性和T細胞的克隆擴增，它們具有高度相似的TCR譜型。另外，此研究還發現TCR庫多樣性和Th17細胞的豐度與RA疾病活動顯著相關。
圖4 RA患者的Th17和EMT細胞的多樣性低于健康對照（HC）[6]，計算D20指數（a）和Shannon指數（b）
圖5 TCRB CDR3s在RA患者的Th17和EMT細胞中高度共享[6]
注：（a）計算Th17和其他亞群之間的Jaccard指數，與健康對照(hc)相比，RA患者Th17和EMT細胞的CDR3s表現出更多的相似性；（b）在RA中，EMT（上）和Th17（下）克隆型的重疊頻率高于私有克隆型；（c）RA和HC重疊克隆型長度分布，RA重疊克隆型明顯長于HC重疊克隆型
此外，多項研究表明，RA患者的循環T細胞表現為TCR庫多樣性降低，其特異性擴增的T細胞克隆型與RA的治療耐藥性和疾病活動狀態相關[3]。
PART 03
I型糖尿病（T1DM）
I型糖尿病（type 1 diabetes mellitus，T1DM）主要是由于遺傳易感人群在環境因素作用下觸發自身免疫反應破壞胰島β細胞，使胰島素分泌不足。 與SLE和RA類似，T1DM患者也發現TCR庫多樣性降低（表3）。
表3 關于I型糖尿病TCR庫的研究[3]
例如，Tong等人[7]為了系統地研究潛在的自身反應性TCRs，使用NGS對9名T1DM患者、4名T2DM患者和6名健康對照組的T細胞進行測序。結果顯示，與T2D患者和健康對照組相比，T1D患者T細胞庫的多樣性顯著降低（圖6）。此外，T1D患者的T細胞克隆高度擴增明顯高于T2D患者和健康對照組。結果表明TCR庫多樣性分析可能成為研究糖尿病的有價值工具。
圖6 CD4+ T細胞TCRB庫的多樣性及克隆指數[7]
注：（a）產生的唯一序列（唯一克隆型）的數量與細胞數量相關（Spearman’s R = 0.85，p < 0.0001）。對測序數據進行歸一化，計算真多樣性指數（b）和Gini系數（c）。來自患者的TN細胞克隆性低于來自健康供體的TN細胞（Mann-Whitney U檢驗）。物種被定義為一個獨特的核苷酸序列。（d-f）真多樣性指數在TN、CM和Tscm細胞亞群之間呈正相關，與CM和Tscm從TN傳代一致（Pearson相關性）。TN，真幼稚細胞；CM，中央記憶細胞；Treg，調節性T細胞；Tscm，干細胞樣記憶T細胞
在另外一項研究[8]中，Gomez-Tourino等人通過分析來自T1DM患者和健康志愿者的循環初始、中樞記憶、調節性和干細胞樣記憶CD4+ T細胞亞群的>2×108個TCRB序列，發現在所有細胞亞群中，患者的TCRB的CDR3序列長度更短，在非生產性TCRB序列中也觀察到高頻率的短CDR3序列（圖7）。此外，與抗病毒T細胞和健康志愿者相比，由自身抗原特異性CD4+ T細胞表達的TCRB CDR3克隆型更短，表明短CDR3序列增加了自我識別的能力，從而增加了自身免疫性疾病的風險。
圖7 在T1D患者中TCRB CDR3s較短以及具有較大的相似性[8]
注：來自（a）TN、（b）CM、（c）Treg和（d）Tscm細胞的TCRB CDR3生產獨特序列的核苷酸長度在患者中呈現偏倚的長度分布。e, f計算了14名健康供體（e）和14名T1D患者（f）的TN和CM TCRB的重疊指數。（g）TN/TN、（h）CM/CM和（i）TN/CM 細胞亞型的重疊指數（Mann-Whitney U檢驗）。*p < 0.05，***p < 0.001。線代表平均值±SD
除上述提到的幾種AIDs外，研究人員還探索了許多其他AIDs患者的TCR庫，如MS、IBD、SSc、PBC等。相關研究總結如表4 [3]。
表4 關于其他自身免疫性疾病TCR庫的研究[3]
PART 04
小結
在過去的幾十年里，人們對T淋巴細胞及其亞群在AIDs的發生和發展中的復雜而重要的作用有了更多的了解，但仍有許多未解之謎，比如TCR庫在AIDS中的細胞和分子機制。了解AIDs患者體內的疾病特異性主克隆型有助于建立一套可靠的生物標志物用于診斷、預測疾病狀態以及發展個性化的免疫治療。
熙寧|精翰NGS實驗室應用基于多重PCR建庫的免疫組庫檢測方法特異性地擴增TCR/Ig受體鏈編碼基因（TRB、TRD、TRG，以及IgH、IgL、IgK），檢測T/B細胞受體基因的克隆性重排，通過專業的生物信息學流程分析識別受體可變區，統計樣本的克隆多樣性及V/J片段的使用頻率，從而揭示個體的免疫表達譜。本檢測方法已經經過了完善的性能驗證，可以供申辦方直接使用。
熙寧|精翰NGS實驗室依據CAP質量的要求，建立了完善的質量體系。實驗室擁有NextSeq CN500測序儀，支持本地測序，且多次滿分通過CAP的能力驗證。按照質量體系的要求，實驗室建立了豐富的檢測方法，全面支撐藥物的安全性評估、治療效果評估、入組篩查和生物標志物的探索等，在藥物研發的各個環節發揮重要作用：
熙寧|精翰NGS平臺可提供的檢測服務
?
以慢病毒為載體的CAR-T細胞治療中，識別有致瘤性的或者其他潛在危險的整合位點，評估整合事件的多樣性和偏好性，輔助評估藥物潛在的安全性風險；
?
通過對腫瘤微小殘留病灶（MRD）的檢測，評估藥物治療效果并提示預后，提前提示復發風險并指導后續干預；
?
通過基因組和轉錄組測序，幫助申辦方識別與疾病關聯的基因突變、融合突變和拷貝數變異等，識別受試者藥物靶點變異情況，以及與藥物轉運、代謝和相關信號通路的基因變化，從而指導患者入排，發現藥物研發的潛在靶點和生物標志物，并指導耐藥機制研究和新的治療策略開發；
?
評估候選藥物對基因表達的影響，篩選出對特定靶標有顯著作用的化合物，同時通過分析藥物處理前后基因表達變化，優化藥物的劑量、作用機制和潛在副作用。
歡迎您后臺留言咨詢。
參考文獻：
[1] Theofilopoulos AN, Kono DH, Baccala R. The multiple pathways to autoimmunity. Nat Immunol. 2017 Jun 20;18(7):716-724. doi: 10.1038/ni.3731. PMID: 28632714; PMCID: PMC5791156.
[2] FANG Xin-yu, LENG Rui-xue, FAN Yin-guang, ZHANG Qin, PAN Hai-feng, YE Dong-qing. Research advances in the epidemiology of autoimmune diseases[J]. CHINESE JOURNAL OF DISEASE CONTROL & PREVENTION, 2021, 25(8): 869-873. doi: 10.16462/j.cnki.zhjbkz.2021.08.001
[3] Song R, Jia X, Zhao J, Du P, Zhang JA. T cell receptor revision and immune repertoire changes in autoimmune diseases. Int Rev Immunol. 2022;41(5):517-533. doi: 10.1080/08830185.2021.1929954. Epub 2021 Jul 9. PMID: 34243694.
[4] Thapa DR, Tonikian R, Sun C, Liu M, Dearth A, Petri M, Pepin F, Emerson RO, Ranger A. Longitudinal analysis of peripheral blood T cell receptor diversity in patients with systemic lupus erythematosus by next-generation sequencing. Arthritis Res Ther. 2015 May 23;17(1):132. doi: 10.1186/s13075-015-0655-9. PMID: 26001779; PMCID: PMC4458014.
[5] Luo W, Ma L, Wen Q, Wang N, Zhou MQ, Wang XN. Analysis of the interindividual conservation of T cell receptor alpha- and beta-chain variable regions gene in the peripheral blood of patients with systemic lupus erythematosus. Clin Exp Immunol. 2008 Dec;154(3):316-24. doi: 10.1111/j.1365-2249.2008.03770.x. Epub 2008 Sep 22. PMID: 18811695; PMCID: PMC2633227.
[6] Jiang X, Wang S, Zhou C, Wu J, Jiao Y, Lin L, Lu X, Yang B, Zhang W, Xiao X, Li Y, Wu X, Wang X, Chen H, Zhao L, Fei Y, Yang H, Zhang W, Zhang F, Chen H, Zhang J, Li B, Yang H, Wang J, Liu X, Zhang X. Comprehensive TCR repertoire analysis of CD4+ T-cell subsets in rheumatoid arthritis. J Autoimmun. 2020 May;109:102432. doi: 10.1016/j.jaut.2020.102432. Epub 2020 Feb 27. PMID: 32115259.
[7] Tong Y, Li Z, Zhang H, Xia L, Zhang M, Xu Y, Wang Z, Deem MW, Sun X, He J. T Cell Repertoire Diversity Is Decreased in Type 1 Diabetes Patients. Genomics Proteomics Bioinformatics. 2016 Dec;14(6):338-348. doi: 10.1016/j.gpb.2016.10.003. Epub 2016 Dec 24. PMID: 28024918; PMCID: PMC5200939.
[8] Gomez-Tourino I, Kamra Y, Baptista R, Lorenc A, Peakman M. T cell receptor β-chains display abnormal shortening and repertoire sharing in type 1 diabetes. Nat Commun. 2017 Nov 27;8(1):1792. doi: 10.1038/s41467-017-01925-2. PMID: 29176645; PMCID: PMC5702608.
