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依據ICH S9 抗腫瘤藥物非臨床評價的指導原則，通常采用嚙齒動物的STD10的1/10或者非嚙齒動物的HNSTD的1/6，經動物和人的種屬轉換后作為起始劑量用于臨床一期藥物劑量設計。該技術路徑有較多的限定條件，比如需要論證動物是相關動物種屬，不適用于免疫激動特性藥物等。大小動物毒理驅動的臨床一期藥物起始劑量設計的濫用會提升藥物首次進入人體的安全性風險，降低一期劑量遞增時研究效率。如ICH S9所描述起始劑量應采用所有已有的非臨床數據（例如藥代動力學、藥效學和毒性）進行科學論證，并且基于多種方法進行選擇。在非臨床階段，引入藥效學數據，特別是基于人來源相關基質的藥效學數據作為選擇之一，是藥物研發從化療藥物進入靶向藥物，從單一作用機理到復雜作用機理，從簡單分子實體到復雜分子實體更加合理的技術路徑，也是更加具備科學依據的選擇。
PART 01
臨床一期藥物劑量設計技術路徑
在藥物研發的進程中，轉化醫學的一個重點研究方向必然包含以下三個問題：
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體外試驗有效/安全，為什么體內試驗無效/不安全？
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體內動物試驗有效/安全，為什么人體試驗無效/不完全？
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如何從體外數據，動物數據能夠較為準確的外推/預測到在人體的安全性和有效性？
關于以上三個問題的研究會貫穿于整個藥物研發的進程，也是提升臨床藥物研發效率的最為關鍵的因素。筆者從臨床一期設計所需的非臨床試驗和數據嘗試回答以上三個轉化醫學的問題。
如下圖1A所示，依據ICH S9 抗腫瘤藥物非臨床評價的指導原則，通常采用嚙齒動物的STD10的1/10或者非嚙齒動物的HNSTD的1/6，經動物和人的種屬劑量轉換后可作為起始劑量用于臨床一期藥物劑量設計[1]。該技術路徑是監管需要，GLP毒理必需要做的內容，且檢測模型非常標準化，也是目前絕大多藥物所采納一期藥物劑量設計的依據。
下圖1B所示，基于動物模型對候選藥物進行藥理藥效評估，基于藥效學結果，經動物和人的種屬劑量轉換后外推到人體的最小起效劑量，結合毒理的最大起始劑量綜合對臨床一期的劑量設計。
1A和1B兩種評估方式建立的前提是相關動物種屬，相關動物種屬的概念有比較重要的內涵，且是需要有試驗數據支撐，這點往往會被忽略，比如動物的靶點蛋白組織表達水平和人體表達水平是否一致，藥物對動物靶點蛋白的效果（如親和力）和人體靶點蛋白的效果（如親和力）是否一致，在這些問題沒有弄清楚前直接采用動物毒理的數據用于臨床一期藥物劑量設計是缺乏科學性的。CD28的超級激動劑TGN1412依據毒理數據決定臨床一期起始劑量在人體試驗中的悲劇后果（受試者發生劇烈的細胞因子釋放，均進了ICU）是非相關動物模型的典型案例[2]。
如圖1C所示，ICH S9也有推薦對于免疫激動類藥物，采用人來源的基質使用體外方法建立藥效學模型，以最小起效劑量（如EC20）換算成人體血藥濃度后作為最小起效劑量用于一期臨床劑量設計，該技術路徑越來越具備科學性和先進性。人來源基質取自于人，沒有非相關性動物模型的困擾；同時來自于人體的基質環境也會影響到藥物在人體的效果（如血漿蛋白結合率的影響），全血/血漿基質的藥效學反應能夠更好的預測藥物進入人體的反應。人來源全血/血漿/PBMC的藥效學模型，是極佳的轉化醫學研究模型，可以回答上述轉化醫學問題。
圖1 FIH臨床一期藥物劑量設計的三條路徑
PART 02
人來源基質的非臨床藥效學研究
首個TCR療法Tebentafusp的體外藥效學評估
Tebentafusp為首個FDA獲批的TCR療法，其為CD3 based雙特異蛋白，靶向gp100特性多肽HLA-A*02:01復合物。由于人免疫系統特異性，很難找到相關性動物模型，Tebentafusp的臨床前研究以及用于首次人體的一期劑量設計采用的是一系列的來自人體全血/PBMC的體外試驗進行有效性，安全性和特異性評估[3]。
如下圖2 Immunocore和Adaptimmune的 科學家介紹了在有效性，安全性和特異性方面進行評價臨床前的體外方法的測試項。
圖2 Tebentafusp一系列來自于人全血基質的體外試驗
其中有效性評估-體外人T細胞激活和殺傷，使用的方法分析：
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基于人PBMC Tebentafusp介導特異性的腫瘤細胞殺傷試驗，采用的是LDH釋放殺傷模型, IncuCyte 凋亡檢測模型，結果見圖3；
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基于人PBMC和特異性的腫瘤細胞作用，Tebentafusp介導的T細胞的激活測定，采用的是ELISPOT檢測IFNγ的T細胞激活性模型。
圖3 Tebentafusp PBMC殺傷試驗結果
通過細胞殺傷試驗中Tebentafusp梯度稀釋的劑量結果，確定Tebentafusp在1pM-1nM的范圍內有有效的殺傷效果，確定最低預期生物有效水平為1pM，用于臨床一期起始劑量的設計。
基于免疫調節劑的動物模型的非相關性，美國先后發表了An FDA oncology analysis of CD3 bispecific constructs and first-inhuman dose selection4，An FDA oncology analysis of immune activating products and first-in-human dose selection5兩篇文章推薦使用基于人免疫細胞的更加具備相關性的體外試驗模型的檢測結果進行CD3雙抗和免疫激動劑的人體首次用量劑量的外推（具體如圖4)。
圖4 FDA推薦使用體外的人免疫細胞試驗的數據外推首次人體劑量
FLT3抑制劑的血漿藥效學評估
如圖5所示， 臨床階段FLT3的藥效學評估可采用PlA (plasma inhibitory assay)方法進行，該方法是將臨床受試者的血漿樣品加入過表達FLT-ITD細胞系中培養孵育，基于細胞系中FLT3磷酸化水平的變化用于藥效學評估，以預測受試者用藥后的效果，FLT3磷酸化水平的變化和患者的預后有較佳的相關性[6]。該方法雖然在臨床實踐中已得到應用，體外方法是否能夠預測體內的反應，其科學性和生理相關性仍然受到質疑，以及PIA的檢測方法能否用于其他靶點藥物一直未得到解答。
2021年來自約翰霍普金斯大學David J. Young 等發表的文章揭示了PIA方法能夠進行患者預后預測的核心因素[7]。小分子藥物和血漿蛋白的結合，會導致人體內起到藥效的游離狀態的藥物減少，最終導致臨床藥效不佳。如下圖6所示臨床階段的候選藥物化Midostaurin，Lestaurtinib，TTT-3002有類似的結構單元，該類似結構單元能夠和血漿中的AGP結合，最終導致藥物效果的極大減弱。同靶點臨床階段的候選藥物Quizartinib, Sorafenib則跟AGP不結合，在人血漿環境中的藥效不會受到顯著性影響，最終發揮生理學作用。基于此基礎研究，在臨床前階段，采用人血漿作為反應基質，通過藥物的體外藥效學評估將是一個很好的體外藥效學模型用于評估預測人血漿蛋白結合率對藥物進入人體后的藥效的影響，以及基于PIA方法的數據可作為臨床一期的最小起效劑量設計的重要參考。
同時作者的研究也表明由于小鼠的AGP蛋白的種屬差異和表達差異，導致小鼠血漿基質對Midostaurin，Lestaurtinib，TTT-3002的影響有限，從血漿蛋白結合的角度來看小鼠動物模型為非相關模型，在研發早期比如PCC階段采用人來源血漿基質進行候選藥物分子的PIA試驗有利于篩選得到更加有生理相關性的藥效分子，減少臨床藥物開發的風險。
圖5 FLT3臨床藥物PIA方法磷酸化抑制結果和預后的相關性分析
圖6 血漿和血漿AGP蛋白對不同結構的FLT3藥物活性的影響
PART 03
熙寧|精翰項目經驗介紹
熙寧生物|精翰生物有非常豐富的臨床階段藥物的藥效學評估的經驗，如圖7所示儲備了全血所有基質組分的方法學庫，可立足于臨床藥物效果進行臨床前人來源全血基質的藥效學評估，并對臨床前的數據進行充分的解讀，助力申辦方的轉化醫學研究和臨床藥物一期劑量設計。
圖7 熙寧生物|精翰生物具備全血所有組分的藥效學方法學庫
同時對于藥物作用機理復雜或者全新藥物靶點的轉化醫學研究，熙寧生物|精翰生物可基于豐富的實踐經驗，深厚的技術積累，前瞻性的研發布局以及經過實戰檢驗的研發體系，進行創新型藥效學方法學開發和新型藥效生物標志物篩選工作，助力臨床前和臨床階段的轉化醫學研究。
圖8 熙寧生物|精翰生物可提供FIC藥物的藥效生物標志物篩選服務
更多人來源基質的方法學和細節的內容詳情見相關公眾號文章[8-15]。
參考文獻:
[1] ICH S9 抗腫瘤藥物非臨床評價指導原則
[2] Stebbings R,etc. "Cytokine storm" in the phase I trial of monoclonal antibody TGN1412: better understanding the causes to improve preclinical testing of immunotherapeutics. J Immunol. 2007 Sep 1;179(5):3325-31.
[3] Harper, Jane , et al. "An approved in vitro approach to preclinical safety and efficacy evaluation of engineered T cell receptor anti-CD3 bispecific (ImmTAC) molecules." PLoS ONE 13.10(2018).
[4] Saber, Haleh , et al. "An FDA oncology analysis of CD3 bispecific constructs and first-in-human dose selection." Regulatory Toxicology & Pharmacology (2017):144-152.
[5] Saber, Haleh , et al. "An FDA oncology analysis of immune activating products and first-in-human dose selection." Regulatory Toxicology & Pharmacology 81(2016):448-456.
[6] Levis, M , et al. "Plasma inhibitory activity (PIA): a pharmacodynamic assay reveals insights into the basis for cytotoxic response to FLT3 inhibitors." Blood 108.10(2015):3477.
[7] Y Young, David J , et al. "A method for overcoming plasma protein inhibition of tyrosine kinase inhibitors. " American Association for Cancer Research (AACR) 5(2021).
[8] 基于人免疫細胞的ADCC功能測定Claudin18.2靶點抗體為例 ---臨床階段的藥效學評估分析方法系列1
[9] 基于人全血的T細胞增殖測定CDK抑制劑為例——臨床階段的藥效學評估分析方法系列2
[10] 基于人血清的補體功能臨床藥效學測定：旁路途徑檢測分析—臨床藥效學評估檢測方法系列3
[11] TYK2抑制劑臨床藥理學的分析方法解析——臨床階段的藥效學評估分析方法系列4
[12] 雙特異藥物的臨床前有效性和安全性評估-上市雙特異藥物Tebentafusp的案例分享
[13] 流式細胞術檢測PD指標—組蛋白H3第27位賴氨酸三甲基化的方法和應用
[14] 免疫調節劑IND申報必檢項- 體外細胞因子釋放試驗方案設計和結果分析
[15] 基于流式細胞術檢測臨床樣品中細胞增殖相關指標-Ki67陽性細胞占比的方法與應用
