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免疫組庫測序打開藥物研發新視野（一）：什么是免疫組庫測序？、免疫組庫測序打開藥物研發新視野（二）：免疫組庫檢測的方法有哪些？兩篇文章介紹了免疫組庫的基本概念、人體內免疫組庫多樣性產生的生物學過程及免疫組庫常用檢測方法。本文將重點介紹免疫組庫測序在TCR相關的腫瘤免疫治療中的應用，并對檢測結果進行生物學意義解讀。
PART 01
TCR在腫瘤免疫治療中發揮核心作用
TCR（T細胞受體）是適應性免疫系統中的關鍵受體，它們在腫瘤治療中發揮核心作用。TCR主要存在于T細胞表面，負責識別并結合由抗原呈遞細胞（如巨噬細胞、樹突狀細胞等）通過MHC分子（主要組織相容性復合體）呈遞的多肽片段。當TCR與抗原-MHC復合物結合后，會觸發T細胞活化和增殖，從而分化為不同的效應子T細胞亞群，包括CD8+ 細胞毒性T細胞和CD4+ 輔助T細胞。
CD8+ 細胞毒性T細胞（CTLs）能夠特異性識別并消滅表達異?？乖哪[瘤細胞。它們通過與腫瘤細胞表面的主要組織相容性復合體（MHC）Ⅰ類分子結合而被激活，該復合體呈遞的是來源于腫瘤細胞內部的多肽片段。當CD8+ T細胞識別到這些抗原后，它們會釋放穿孔素、顆粒酶和其他效應因子，導致靶向的腫瘤細胞裂解死亡。
CD4+ 輔助T細胞（Th cells）能夠識別抗原呈遞細胞（如樹突狀細胞）上MHCⅡ類分子結合的肽段，并通過與這些細胞相互作用而被激活。激活后的CD4+ T細胞可以分化為不同的輔助亞型，包括Th1、Th2、Th17等，分別分泌不同類型的細胞因子來激活和調控其他免疫細胞。并且通過分泌細胞因子來調節其他免疫細胞的功能，包括促進B細胞產生抗體（參與體液免疫），以及激活巨噬細胞、自然殺傷細胞等進行細胞介導的免疫反應，這對于疫苗誘導的免疫應答至關重要。
腫瘤免疫治療通過增強患者的免疫系統識別和攻擊腫瘤細胞的能力，或克服腫瘤細胞免疫逃逸機制，從而達到控制、縮小甚至消除腫瘤的目的，包括但不限于免疫檢查點抑制劑、CAR-T細胞療法、腫瘤疫苗以及腫瘤浸潤淋巴細胞（TILs）療法等。腫瘤免疫治療通過多種機制直接影響免疫系統中各類免疫細胞的數量、種類和功能狀態，TCR免疫組庫測序可以檢測腫瘤特異性的T細胞克隆、評估腫瘤微環境的免疫狀態、評估免疫治療效果、監測治療前后的免疫應答變化，并且可以輔助預測治療反應與患者預后。
PART 02
單個樣本TCR免疫組庫測序結果
熙寧|精翰NGS實驗室開發了成熟的免疫組庫測序生信分析流程，對檢測樣本進行 T 細胞受體基因克隆鑒定檢測，并對受檢者的不同時間節點的樣本進行 T 細胞受體基因克隆鑒定檢測，對特定的TCR 的克隆比例，克隆多樣性、V/J 基因的使用頻率進行統計，識別樣本間的共有克隆，并追蹤不同樣本 TCR 指標的動態變化，如克隆總數、克隆類型、多樣性指數、克隆豐度等，輔助評估免疫治療的臨床效果。
本文將以TRB為例，從克隆多樣性、CDR3長度分布、V-J基因使用頻率分布等方面對單個樣本的TCR免疫組庫測序結果進行展示，并從生物學角度對檢測結果進行解讀（注：圖示中所有數據均來自虛擬樣本）。
2.1 克隆多樣性
計算樣本TCR組成多樣性的指標有Shannon’s entropy，Inverse Simpson’s index，Evenness，Clonality。
? Shannon’s entropy 計算公式：
? Inverse Simpson’s index 計算公式：
? Evenness 計算公式：
? Clonality 計算公式：
其中：s 表示實際觀測到的 TCR 重組序列的數目；Pi表示第 i 個 TCR 重排序列在所有 TCR 中所占的比例。
Shannon 和 Inverse Simpson 值越大，說明樣本的 TCR 多樣性越高。Evenness 的取值范圍為 0~1，指樣本的均勻度。 Clonality 的取值范圍為 0~1，指樣本的克隆性。
TCR克隆多樣性與年齡呈顯著正相關，隨著年齡的增加TCR的多樣性呈現下降趨勢。TCR多樣性的異常增高，與免疫系統訓練不充分有關；TCR多樣性的異常減少與免疫缺陷、免疫系統發育不全以及腫瘤性或反應性T細胞大量擴增有關。
2.2 CDR3 長度分布
在某些疾病狀態下，例如自身免疫性疾病、某些感染疾病（如HIV感染）以及癌癥，可能會觀察到TCR CDR3長度譜的改變。比如，在某些腫瘤患者中，可能會發現TCR CDR3的長度分布出現偏移，這可能是由于腫瘤特異性T細胞克隆擴增或者免疫反應失衡所導致。此外，某些病毒感染后，為了應對病毒抗原變異，T細胞庫可能會產生更多具有特定CDR3長度的克隆。
統計樣本內CDR3區域的核苷酸序列的長度分布與頻率的關系，柱狀圖分別由頻率最高的20種CDR3氨基酸序列與V片段填充，結果分別見圖1與圖2：
圖1 CDR3 核苷酸序列長度與Top20 序列分布直方圖
上圖中橫坐標表示CDR3核苷酸序列的長度，縱坐標表示對應長度CDR3數量在所有CDR3的比例，展示頻率最高的20種CDR3的多肽序列。
圖2 CDR3 核苷酸序列長度與Top V片段分布直方圖
上圖中橫坐標表示CDR3核苷酸序列的長度，縱坐標表示對應長度CDR3數量在所有CDR3的比例，展示頻率最高的 20 種 V 片段的分布。
2.3 V/J片段使用頻率統計
截止到2024年2月26日，根據IMGT數據庫的統計，人類基因組總共包含 237-243 個 TR 基因，具體基因數取決于單倍體類型。每個單倍體基因組的功能性 TR 基因數量為 172-185。TR基因在染色體上的分布及各片段的數目統計如下表：
統計樣本內V片段與J片段的使用頻率，結果分別見圖3與圖4，并統計V-J對的組合與使用頻率，結果見圖5與圖6：
圖3 V 基因使用頻率分布直方圖
上圖中橫坐標表示不同的V片段的名稱，縱坐標表示對應V片段的使用頻率。
圖4 J 基因使用頻率分布直方圖
上圖中橫坐標表示不同的 J 片段的名稱，縱坐標表示對應 J 片段的使用頻率
圖5 V-J 基因對使用頻率分布環形圖
上圖為 V-J 對使用頻率分布環形圖?；诓煌?V 片段和 J 片段，按其在樣本中的頻率進行縮放。絲帶代表 V-J 配對，其大小按配對頻率縮放
圖6 V-J 基因對使用頻率分布三維柱狀圖
上圖為 V-J 對三維柱狀圖。其中 X 軸表示 V 片段的名稱，Y 軸表示 J 片段的名稱，Z 軸表示克隆頻率。
在疾病進程中，TCR V和J基因的使用頻率偏好性可能出現顯著變化。這是因為疾病狀態下，某些特定的T細胞克隆可能因為針對某種抗原的高親和力而被強烈激活和擴增，從而導致某些V或J基因的使用頻率增加。例如，在某些類型的腫瘤中，已發現存在腫瘤特異性T細胞克隆的富集，表現為TCR V和J基因使用頻率的非隨機性分布。另一方面，在某些疾病相關的抗原刺激下，某些特定的TCR克隆占主導地位時，可能導致TCR多樣性下降，使得原本廣泛分布的V或J基因使用頻率變得集中。
隨著年齡的增長，免疫系統經歷正常的生理衰老過程，稱為免疫衰老。在這個過程中，T細胞庫的多樣性可能會減少，一部分高頻使用的V或J基因組合可能會更頻繁地出現，同時罕見的組合可能減少，導致整體TCR多樣性降低。
此外，老年個體可能對新抗原的免疫響應減弱，這也可能影響TCR V和J基因的使用頻率偏好性，使其傾向于維持以前接觸過的抗原的記憶反應，而不是產生新的克隆來應對新挑戰。
TCR V和J基因的頻率偏好性與疾病進程或年齡的相關性是復雜的，依賴于多種因素，包括個體的遺傳背景、環境暴露、疾病類型和嚴重程度等。
PART 03
小結
在腫瘤過繼性免疫治療中，如CAR-T細胞療法和TILs免疫療法，對治療后的受檢者的不同時間節點的樣本進行TCR免疫組庫測序，統計注射液的TCR克隆殘留比例，識別樣本間的共有克隆，并追蹤不同樣本TCR指標的動態變化，可以輔助評估藥物的治療效果。下期文章即將介紹在腫瘤免疫治療中對時序樣本的檢測，敬請期待。
熙寧|精翰NGS實驗室應用基于多重PCR建庫的免疫組庫檢測方法特異性地擴增TCR/Ig受體鏈編碼基因（TRB、TRD、TRG，以及IgH、IgL、IgK），檢測T/B細胞受體基因的克隆性重排，通過專業的生物信息學流程分析識別受體可變區，統計樣本的克隆多樣性及V/J片段的使用頻率，從而揭示個體的免疫表達譜。本檢測方法已經經過了完善的性能驗證，可以供申辦方直接使用。
熙寧|精翰NGS實驗室依據CAP質量的要求，建立了完善的質量體系。實驗室擁有NextSeq CN500測序儀，支持本地測序，且多次滿分通過CAP的能力驗證。按照質量體系的要求，實驗室建立了豐富的檢測方法，全面支撐藥物的安全性評估、治療效果評估、入組篩查和生物標志物的探索等，在藥物研發的各個環節發揮重要作用：
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以慢病毒為載體的CAR-T細胞治療中，識別有致瘤性的或者其他潛在危險的整合位點，評估整合事件的多樣性和偏好性，輔助評估藥物潛在的安全性風險；
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通過對腫瘤微小殘留病灶（MRD）的檢測，評估藥物治療效果并提示預后，提前提示復發風險并指導后續干預；
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通過基因組和轉錄組測序，幫助申辦方識別與疾病關聯的基因突變、融合突變和拷貝數變異等，識別受試者藥物靶點變異情況，以及與藥物轉運、代謝和相關信號通路的基因變化，從而指導患者入排，發現藥物研發的潛在靶點和生物標志物，并指導耐藥機制研究和新的治療策略開發；
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評估候選藥物對基因表達的影響，篩選出對特定靶標有顯著作用的化合物，同時通過分析藥物處理前后基因表達變化，優化藥物的劑量、作用機制和潛在副作用。
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