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嵌合抗原受體T細胞（Chimeric Antigen Receptor T Cell，CAR-T）治療產品因其在血液腫瘤中的顯著療效，已成為國際腫瘤免疫治療研究領域中的新熱點，也成為治愈腫瘤的新希望。
但是，在CAR-T細胞產品的生產中存在復制型病毒（Replication Competent Virus，RCV）污染的潛在風險，監管機構要求對于臨床使用的慢病毒或逆轉錄病毒載體，轉導的CAR-T細胞產品和患者均要進行復制型病毒的檢測。
PART 01
什么是復制型病毒？
在CAR-T細胞治療產品的制備過程中，通常利用慢病毒載體或逆轉錄病毒載體將CAR基因高效地導入T細胞中，但在使用這些病毒載體的同時也帶來了CAR-T產品污染復制型逆轉錄病毒（Replication Competent Retrovirus，RCR）或復制型慢病毒（Replication Competent Lentivirus，RCL）的潛在風險。RCL和RCR都可以稱為復制型病毒（RCV），RCV通過病毒載體回復突變產生，是具有復制能力的病毒。
PART 02
復制型病毒對患者有哪些安全性風險？
RCL/RCR對患者的風險表現在兩個方面：
（1）它們同逆轉錄病毒載體一樣可以整合在細胞基因組中，這種整合可能使得一種能夠激活原癌基因，破壞抑癌基因或使促細胞生長的因子表達增高，從而增加二次腫瘤的風險；
（2) 因其具有復制性，即可產生具有復制能力的病毒，加之采用了可感染多種細胞的膜蛋白，大大增加了整合造成二次腫瘤的風險。
盡管在逆轉錄病毒載體或慢病毒載體發展的過程中，研究者一直在采取多種措施（包括載體的設計、病毒載體包裝方法等）以降低RCR/RCL的風險，基本消除了RCL重組產生的可能性，但仍不能完全排除污染的風險，因此RCL/RCR的污染風險始終是藥品監管機構一個重要的關注點。
PART 03
復制型病毒是如何產生的？
目前，制備CAR-T細胞所用的慢病毒載體和γ-逆轉錄病毒載體均為復制缺陷型載體，這在理論上大幅降低了產生復制型病毒的風險。然而，在病毒載體的制備方法以及制備過程中，仍存在產生RCL或RCR的潛在風險。這些風險主要來自于在病毒載體生產過程中，穿梭質粒、包裝質粒及包裝細胞中的內源性逆轉錄元件之間，或病毒載體與T細胞的內源性逆轉錄元件之間，發生的同源或非同源重組。
由此可見，RCV可能產生在病毒載體生產階段，也可能產生在CAR-T細胞制備階段。并且在患者接受治療后，隨著CAR-T細胞在體內的持續擴增，也依然存在產生RCV的潛在風險。
圖1 細胞治療產品生產流程
PART 04
復制型病毒的監管要求
針對RCV的風險，中國、美國及歐洲的藥品監管機構均發布了明確的指導原則，要求在病毒載體的設計上應盡可能降低與野生型病毒相關的任何致病性，并盡可能將病毒重組和回復突變的風險降到最低。同時，在產品的生產和應用的不同階段進行RCL的控制，以保障患者的用藥安全。相關法規指南如下：
表1 復制型病毒相關的法規指南
PART 05
RCR/RCL檢測的方法
《CAR-T細胞治療產品質量控制檢測研究及非臨床研究考慮要點》提到，目前RCR/RCL的檢測方法主要有指示細胞培養法、ELISA法(p24蛋白測定)、PCR/qPCR法（通過psi-gag或VSV-G聚合酶鏈反應）和轉錄酶活性測定法(PERT)等。其中，qPCR法因其具有檢測時間短、環境條件簡單、靈敏度高和可重復性強等優點，被許多CAR-T申報企業作為快速放行方法。
熙寧生物|精翰生物目前已獨立建立了多種qPCR檢測RCL/RCR的方法，檢測的目標基因涵蓋慢病毒載體包膜VSV-G、逆轉錄病毒載體包膜GALV，以及貓內源性逆轉錄病毒RD114等，最低靈敏度能夠達到2或5拷貝數/反應。此外，我們還與合作伙伴共同建立了基于細胞培養法的RCL檢測方法。以上提及的多種方法均已進行驗證，可供申辦方直接使用。
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