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數字PCR通過單個模板分子的PCR擴增，擺脫了擴增效率的限制，可實現不依賴于標準曲線和參照樣本的絕對定量。作為一種準確、高靈敏度的定量PCR技術，在醫學、環境科學和食品安全等領域具有廣泛的應用前景。
PART 01
數字PCR介紹
數字PCR檢測流程可大致概括為3個步驟：
Partition 將傳統PCR中的單一體系進行稀釋，分散成幾萬個微滴，分散數量越多，每個單元中目標分子濃度越高，起始低濃度靶分子的檢測可能性就越大，檢測靈敏度就越高。 Amplification 每個微滴中進行獨立的PCR擴增，檢測靈敏度提高的同時也能夠有效降低反應體系中化合物的干擾。 Analysis 擴增結束后檢測各個獨立反應單元的熒光信號，根據泊松分布原理進行分析，得出待測靶分子的拷貝數。
PART 02
基于泊松分布 (Poisson Distribution) 的絕對定量
數字PCR的高精確度除了與其前期樣本分散有關外，另一個重要的原因就是在數字PCR檢測分析中引入了泊松分布原理。
理論上，DNA分子可以平均分配到各獨立的反應單元中，檢測時有熒光信號就可直接判讀為目標分子的拷貝數。但實際操作中，DNA分子是隨機分布的，每個反應單元可能包含兩個或兩個以上的目標分子。
圖1 理想情況下和實際情況下DNA分子分布對比
假設反應體系中總的靶基因拷貝數為m，獨立的反應單元為n，每個反應單元中靶基因拷貝數：λ=m÷n ， 由于每個單元中實際包含的靶基因拷貝數是離散的（0、1、2……），那么分區中包含k個靶基因拷貝數的概率服從泊松分布：
數字PCR采用終點法檢測，即使微滴中只含有1個靶基因拷貝也能被檢測到，儀器通過分辨各反應單元的陰陽性情況，通過陰性反應單元的比例和樣品稀釋倍數（或微滴數），采用泊松分布的概率公式進行計算，即可獲得樣品的拷貝數濃度，實現DNA的精確定量。
PART 03
數字PCR方法驗證
數字PCR以其更高的準確度及靈敏度等優勢，在基因和細胞治療產品的生物分析領域得到了日益廣泛的應用。2020年和2021年的《生物分析白皮書》深入討論了qPCR和dPCR之間的差異。在2021年的專家共識建議基礎上，2022年的GCC白皮書從CRO的角度出發，對dPCR的開發和驗證達成了更多共識。目前，數字PCR平臺建議的驗證項包括精密度、準確度、靈敏度、選擇性、定量下限和穩定性等關鍵指標。
微滴數量（對于微滴式數字PCR）
根據使用儀器的不同，實驗可生成的微滴數量也各有差別，微滴數量過低不適用于泊松分布，檢測結果可信度也將變低，方法驗證中應設定合適的接受標準。
標準曲線
區別于qPCR檢測，數字PCR僅在驗證階段需要在分析批中設置標準曲線，用于驗證方法的準確度、精密度及線性范圍；樣品分析中，數字PCR無需標準曲線參與計算即可得出待測樣品的拷貝數結果。
對于濃度≥50 copies/20 μL反應體系的標準曲線點，接受標準為%RE在±35 %以內，%CV ≤40%；對于濃度＜50 copies/20 μL反應體系的標準曲線點，接受標準為%RE在±50 %以內，%CV ≤80%。
陽性對照
分析批中使用陽性對照（包含目的基因片段的質?；騺碜躁栃约毎幕蚪MDNA等）來監控方法的穩定性。
定量下限
關于dPCR的定量下限（LLOQ），GCC白皮書（2021年）和2022年《生物分析白皮書》中之前關于50 copies /μg DNA的建議仍然適用，LLOQ的測定同時也應考慮儀器的理論%CV和背景gDNA量，以力求達到白皮書推薦的50拷貝/μg DNA靈敏度。
熒光校正
進行多通道檢測時，各熒光通道之間可能會產生熒光串擾，此時可通過熒光校正實驗（實驗中包含negative control和單色陽性control）進行調節。
PART 04
數字PCR技術優勢和展望
數字PCR技術在既往的研究中凸顯出諸多優勢：
? 反應和結果判讀受擴增效率影響大大降低； ? 對PCR反應抑制物的耐受能力大大提高； ? 數字PCR實驗中標準反應體系分配的過程可以極大程度上降低與目標序列有競爭性作用的背景序列濃度，適用于在復雜背景中檢測稀有突變； ? 與傳統熒光定量PCR相比，有更加出色的靈敏度、特異性和準確性，在極微量核酸樣本檢測、表達量微小差異鑒定、拷貝數變異檢測等方面的應用已被廣泛認可。
隨著科學技術的不斷進步，數字PCR系統正變得越來越靈活，性能在不斷提高，多重檢測與分析得到改善，相信數字PCR系統將很快進入臨床診斷的應用，為生物研究提供更精準可靠得核酸分子檢測與定量分析。
PART 05
熙寧生物|精翰生物PCR平臺服務方案
熙寧生物|精翰生物基因檢測平臺配備了法國Stilla Technologies公司NaicaTM crystal全自動微滴芯片數字PCR儀系統（Nicia Geode微滴生成/擴增系統&Nicia Prism3微滴讀取與分析系統），3色檢測系統，兼容多重檢測性能，靈敏度能夠達到2拷貝每反應，可以從方法開發，方法驗證，以及樣本檢測等方面提供一站式全方位的支持。
歡迎后臺留言咨詢。
