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熙寧小課-第167期 | RNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序：從諾貝爾獎(jiǎng)發(fā)現(xiàn)到藥物研發(fā)的精準(zhǔn)應(yīng)用
PART 01
諾貝爾生理學(xué)醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)microRNA
2024年諾貝爾生理學(xué)醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)授予科學(xué)家維克托·安布羅斯（Victor Ambros）和加里·魯夫昆（Gary Ruvkun），以表彰他們發(fā)現(xiàn)了微小RNA（microRNA）及其在轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控中的作用。這不僅是對(duì)microRNA在生物學(xué)基礎(chǔ)研究中的重要性的認(rèn)可，更為藥物研發(fā)和臨床應(yīng)用帶來(lái)了新的機(jī)遇。
圖1 遺傳信息從DNA到mRNA再到蛋白質(zhì)的流動(dòng)
要理解這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)的重要性，我們需要先了解生物體內(nèi)基因表達(dá)的基本過(guò)程。RNA作為中心法則的重要組成部分，起著承上啟下的作用。它不僅是遺傳信息傳遞的橋梁，也是基因表達(dá)調(diào)控的重要參與者。在細(xì)胞內(nèi)，RNA負(fù)責(zé)將存儲(chǔ)在DNA中的遺傳信息轉(zhuǎn)錄為可用于合成蛋白質(zhì)的信使RNA，并通過(guò)翻譯轉(zhuǎn)化為具有生物功能的蛋白質(zhì)。這一過(guò)程使得細(xì)胞能夠精確地響應(yīng)內(nèi)外部環(huán)境的變化，從而保持生命活動(dòng)的正常進(jìn)行。
microRNA是一類(lèi)很短的RNA分子，通常只有20~24個(gè)核苷酸長(zhǎng)。這些微小分子不產(chǎn)生蛋白質(zhì)，而是通過(guò)影響其他 RNA分子來(lái)調(diào)節(jié)基因的活動(dòng)。上世紀(jì)80年代，Ambros和 Ruvkun在研究線(xiàn)蟲(chóng)生長(zhǎng)相關(guān)的生理學(xué)機(jī)制時(shí)，偶然發(fā)現(xiàn)lin-4 基因產(chǎn)生的一小段microRNA，就像一個(gè)微型密碼，而這個(gè)密碼恰好能部分匹配lin-14基因末端的一些重復(fù)片段，當(dāng)兩個(gè)分子相結(jié)合，就會(huì)阻止lin-14產(chǎn)生蛋白質(zhì)。
然而，這個(gè)發(fā)現(xiàn)一開(kāi)始并沒(méi)有引起太多關(guān)注。直到2000 年，Ruvkun 的實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)了名為let-7的第二個(gè)microRNA。let-7不僅存在于線(xiàn)蟲(chóng)中，還在人類(lèi)和其他動(dòng)物中被發(fā)現(xiàn)，這意味著microRNA調(diào)控機(jī)制在動(dòng)植物界具有普遍性，由此引起了科研界的深度重視與廣泛研究。
PART 02
RNA的分類(lèi)及功能
隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，RNA的研究也不斷深化。高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展使得研究人員能夠全面分析細(xì)胞內(nèi)的RNA組成，揭示不同細(xì)胞類(lèi)型和狀態(tài)下的轉(zhuǎn)錄組特征。RNA根據(jù)是否編碼蛋白質(zhì)可以分為編碼RNA（coding RNA）與非編碼RNA（non-coding RNA）。
編碼RNA（coding RNA）
編碼RNA即我們常知的mRNA，負(fù)責(zé)將DNA中的遺傳信息轉(zhuǎn)錄為蛋白質(zhì)。mRNA在細(xì)胞核中合成后，經(jīng)過(guò)一系列的加工和修飾（如加上5'帽和3'聚腺苷酸尾）后轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，供翻譯使用。
mRNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序通過(guò)比較不同組織類(lèi)型、發(fā)育階段或處理?xiàng)l件下的轉(zhuǎn)錄組，揭示基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化。分析基因的表達(dá)水平可以揭示疾病相關(guān)的基因表達(dá)變化，幫助藥企與研究人員深入理解疾病機(jī)制，優(yōu)化藥物療效和安全性。
非編碼RNA（non-coding RNA）
非編碼RNA（non-coding RNA）通過(guò)多種機(jī)制互相作用，共同調(diào)控基因表達(dá)的各個(gè)階段。它們不僅影響轉(zhuǎn)錄后過(guò)程，還參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)、代謝調(diào)節(jié)和細(xì)胞周期等重要生物過(guò)程。
除tRNA與rRNA外，其他非編碼RNA如微小RNA（microRNA）可以通過(guò)結(jié)合到目標(biāo)mRNA上，抑制其翻譯或?qū)е缕浣到猓瑥亩{(diào)節(jié)特定基因的表達(dá)水平；長(zhǎng)鏈非編碼RNA （lncRNA）則通過(guò)與DNA、RNA或蛋白質(zhì)相互作用，調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄和其他細(xì)胞過(guò)程；環(huán)狀RNA （circle RNA）以環(huán)狀結(jié)構(gòu)存在，通常由內(nèi)含子剪接產(chǎn)生，吸附并抑制特定microRNA的功能，從而調(diào)節(jié)microRNA靶基因的表達(dá)；小干擾RNA （siRNA）是一類(lèi)雙鏈小RNA，參與RNA干擾（RNAi）機(jī)制，通過(guò)降解特定mRNA來(lái)沉默基因表達(dá)；小核RNA（snRNA）主要存在于細(xì)胞核內(nèi)，參與mRNA前體的剪接及其他RNA加工過(guò)程；小核仁RNA（snoRNA）主要位于核仁中，參與rRNA的化學(xué)修飾和加工等等。這些非編碼RNA的發(fā)現(xiàn)不僅豐富了中心法則的內(nèi)涵，還為理解基因調(diào)控的復(fù)雜性提供了新視角。
非編碼RNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序正日益成為推動(dòng)藥物研發(fā)和精準(zhǔn)醫(yī)療的重要工具。通過(guò)非編碼RNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，藥企能夠識(shí)別與特定疾病相關(guān)的非編碼RNA，從而發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點(diǎn)；由于非編碼RNA在體液中（如血液和尿液）相對(duì)穩(wěn)定，其表達(dá)水平也可以用于早期診斷和疾病預(yù)后評(píng)估；通過(guò)對(duì)特定非編碼RNA的功能研究，能夠揭示其在疾病發(fā)生過(guò)程中的作用，不僅有助于深入理解疾病的分子機(jī)制，還可以為開(kāi)發(fā)新型治療策略提供理論依據(jù)；例如，lncRNA通過(guò)調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄或參與染色質(zhì)重塑，影響細(xì)胞增殖、分化和凋亡等過(guò)程。通過(guò)監(jiān)測(cè)特定非編碼RNA的表達(dá)變化，研究人員能夠判斷藥物是否有效，并識(shí)別潛在的副作用。這種實(shí)時(shí)的監(jiān)測(cè)手段有助于優(yōu)化治療方案，最大限度地提高藥物的療效和安全性。
PART 03
實(shí)驗(yàn)端檢測(cè)：RNA-Seq建庫(kù)流程
圖２ 熙寧|精翰轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)嶒?yàn)技術(shù)路線(xiàn)
以mRNA建庫(kù)為例，總RNA抽提后需要測(cè)定濃度和純度，同時(shí)由于RNA容易降解，需要通過(guò)電泳測(cè)定RNA的完整度。
總RNA中含有大量的核糖體 RNA (rRNA)，約占總RNA 80-98%。對(duì)絕大多數(shù) RNA-Seq 應(yīng)用來(lái)說(shuō)，需要去除 rRNA 或捕獲mRNA，從而保證測(cè)序數(shù)據(jù)集中在轉(zhuǎn)錄組所需的部分并節(jié)省成本。mRNA的富集通常有兩種方式，Poly(A)捕獲使用Oligo(dT) 分子雜交mRNA的Poly(A)尾從而實(shí)現(xiàn)mRNA的富集。poly(A) 富集需要高質(zhì)量的 RNA，如果是放置時(shí)間長(zhǎng)的組織樣本，RNA可能降解斷裂，同時(shí)由于對(duì) poly(A) 尾的選擇，3' 端被富集，而5' 序列容易丟失，因此Poly(A)捕獲常存在捕獲效率低和偏好性的問(wèn)題。
熙寧生物｜精翰生物采用rRNA去除的方法，rRNA去除原理是通過(guò)互補(bǔ)DNA寡核苷酸雜交和RNA酶H消化，去除與DNA寡核苷酸雙鏈化的rRNA和珠蛋白mRNA（mRNA中珠蛋白mRNA約占30%-70%），然后進(jìn)行DNA酶處理以清除DNA寡核苷酸。rRNA去除的方法效率更高，可以保留更豐富的mRNA分子。
隨后經(jīng)過(guò)片段化和逆轉(zhuǎn)錄合成DNA，再經(jīng)過(guò)加A和接頭連接，以及擴(kuò)增和純化，即完成建庫(kù)。由于DNA的兩條鏈均可以作為模板轉(zhuǎn)錄mRNA，如果無(wú)法區(qū)分模板的來(lái)源則會(huì)發(fā)生干擾。熙寧生物｜精翰生物采用鏈特異性建庫(kù)，保留了轉(zhuǎn)錄本的方向信息，可區(qū)分轉(zhuǎn)錄本的來(lái)源，避免了互補(bǔ)鏈的干擾。
PART 04
生信端分析：轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析
圖３ 熙寧|精翰轉(zhuǎn)錄組測(cè)序生信分析流程
熙寧生物｜精翰生物的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序生信分析流程包括多個(gè)關(guān)鍵步驟，以確保數(shù)據(jù)的高質(zhì)量和準(zhǔn)確性。首先，進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理，涵蓋數(shù)據(jù)拆分、測(cè)序元件序列去除、質(zhì)量控制和過(guò)濾，以及質(zhì)量指標(biāo)統(tǒng)計(jì)。經(jīng)過(guò)質(zhì)控的數(shù)據(jù)將被比對(duì)至參考基因組，統(tǒng)計(jì)比對(duì)率和測(cè)序深度等指標(biāo)。根據(jù)基因組特征，統(tǒng)計(jì)每個(gè)基因的表達(dá)豐度（RC，Ｒead Ｃount）并進(jìn)行基因注釋?zhuān)梢暬虻谋磉_(dá)水平，進(jìn)行樣本相關(guān)性分析及主成分分析，并針對(duì)有重復(fù)樣本和任意分組的無(wú)重復(fù)樣本進(jìn)行差異基因分析與差異基因功能富集分析。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的高級(jí)分析包括蛋白網(wǎng)絡(luò)分析、基因集差異分析、基因集富集分析、免疫浸潤(rùn)分析等。合并統(tǒng)計(jì)多個(gè)樣本的質(zhì)控信息進(jìn)行綜合分析和展示。通過(guò)這一系統(tǒng)流程，為客戶(hù)提供全面而深入的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析服務(wù)。
部分結(jié)果展示：
圖４ 熙寧|精翰轉(zhuǎn)錄組測(cè)序生信分析結(jié)果部分展示
PART 05
熙寧｜精翰生物RNA-Seq檢測(cè)服務(wù)
在生物醫(yī)學(xué)研究和藥物開(kāi)發(fā)的前沿，熙寧生物｜精翰生物轉(zhuǎn)錄組測(cè)序服務(wù)已完成分析性能驗(yàn)證，可全面分析組織、血液、石蠟包埋切片等樣本的mRNA表達(dá)情況，采用Roche KAPA試劑進(jìn)行rRNA去除和鏈特異性文庫(kù)構(gòu)建，保證文庫(kù)質(zhì)量和數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性，使用Illumina測(cè)序儀完成上機(jī)測(cè)序。生信流程覆蓋基因差異表達(dá)分析、差異基因功能和通路注釋等，最終出具完整全面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告，可在5~8個(gè)工作日內(nèi)完成樣本分析全流程，助力申辦方開(kāi)展藥物作用機(jī)制研究和生物標(biāo)志物研究。
