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細胞與基因治療領域近年來取得了令人矚目的突破，在惡性腫瘤、遺傳病、罕見病等治療中展現出巨大潛力，為眾多患者帶來了新希望。隨著CAR-T療法、基因編輯技術、溶瘤病毒等創新療法相繼獲批上市，細胞與基因治療的臨床應用愈發廣泛。
PART 01
細胞與基因治療安全性風險及合規性要求
細胞與基因治療產品通常借助病毒或非病毒載體，將外源基因導入靶細胞或組織，以實現基因替代、補償、修正或敲除等治療目的。但是，病毒或非病毒載體在宿主基因組中的隨機整合，可能引發插入性突變，進而導致克隆擴增甚至腫瘤形成。BluebirdBio的體外干細胞基因治療產品SKYSONA，用慢病毒載體導入外源基因，治療腎上腺腦白質營養不良。開發過程中有 3例兒童被診斷出骨髓增生異常綜合征（Myelodysplastic Syndrome，MDS），其中2例因慢病毒整合到原癌基因的克隆擴增所致 [1] 。2023年7月起，FDA調查已獲批上市的6款CAR-T產品治療后發生T淋巴細胞瘤的情況，確定這些CAR-T療法存在繼發性 T 細胞惡性腫瘤風險。對3例接受CAR-T治療后發生癌變的患者基因測序，發現惡性細胞克隆中存在CAR基因。2024年4月18日，FDA正式要求更新黑框警告，提醒患者和處方醫師相關風險，要求患者和臨床試驗參與者終身監測 [2-3] 。
因此，整合位點分析作為一項關鍵技術，在評估細胞與基因治療產品的安全性方面發揮著舉足輕重的作用。它不僅是合規要求，更是保障細胞與基因治療長期安全性的關鍵工具。中國CDE和美國FDA等各國監管機構，已發布多項指導文件，明確要求開展整合位點分析，以評估插入性突變的風險。在藥學和非臨床安全性研究階段，需要關注基因整合情況、插入位點和拷貝數，分析基因組改變特征，評估潛在風險。在臨床研究階段，需要長期隨訪監測克隆形成和繼發腫瘤風險。整合位點分析不僅助力申辦方滿足法規要求，更為產品的上市和臨床推廣提供了有力支持。
PART 02
整合位點檢測和分析方法解析
隨著高通量測序與生物信息學分析技術的發展，整合位點檢測與注釋分析已可以為理解和判斷風險提供重要的數據信息。現有的整合位點的檢測多是基于分子生物學的方法，包括線性擴增介導的PCR（Linear Amplification-mediated PCR，LAM-PCR）、非限制性線性擴增介導的PCR（Non-restrictive Linear Amplification-mediated PCR, nrLAM-PCR）、連接介導的PCR（Ligation-mediated PCR，LM-PCR）、靶向富集測序（Target Enrichment Sequencing，TES）和全基因組測序（Whole Genome Sequencing, WGS）。其優缺點比較如下表：
表1 整合位點檢測方法學比較
整合位點測序的數據有許多公共的分析方法或軟件供使用，如INSPIIRED、PIC、IS-Seq和VISPA2等，可分析整合位點在基因組中的位置、分布、功能區，以及癌基因與非癌基因偏好性和多樣性指數（如Chao1、香農指數、基尼系數和UC50等），綜合評估整合位點安全性風險。
隨著細胞與基因治療從腫瘤向自身免疫疾病適應癥的拓展，整合位點分析將在療法安全性的縱向監測中發揮更為關鍵的作用，為保障患者安全、推動細胞與基因治療領域的健康發展持續貢獻力量。
PART 03
精翰生物整合位點檢測介紹
精翰生物具備細胞與基因治療中常見的慢病毒、逆轉錄病毒和非病毒載體（如轉座子等）等整合位點檢測和分析的能力。精翰生物的整合位點檢測方法具有自主知識產權，自主設計錨定接頭和引物，基于LM-PCR（Ligation-mediated PCR）的原理，針對載體LTR/ITR（Long terminal repeats/Inverted terminal repeats）區域進行2輪巢式PCR擴增，經過測序和生信分析，識別整合位點的位置、分布和所在功能區，并對偏好性和多樣性進行統計學分析。此外，接頭中還設計了分子標簽（Unique molecular identifier，UMI），可以實現整合位點相對豐度的計算。有利于識別異常的單克隆或寡克隆。LM-PCR也是FDA獲批藥物評審報告中推薦的檢測方法 [4] 。
精翰生物慢病毒整合位點檢測已完成性能驗證，全面支持全血、細胞注射液和DNA等樣本的檢測，具備豐富的經驗，成功支持了多家申辦方的IND申報、注冊臨床和長期隨訪，助力細胞與基因治療藥物的安全性檢測。
圖1 LM-PCR建庫原理示意圖
參考文獻：
[1] FDA. Cellular, Tissue, and Gene Therapies Advisory Committee Meeting [EB/OL]. 2022-06-09 [2024-10-24]. https://www.fda.gov/media/159010/download
[2] VERDUN N, MARKS P. Secondary Cancers after Chimeric Antigen Receptor T-Cell Therapy[J]. N Engl J Med. 2024, 390(7): 584-586.
[3] FDA. FDA Requires Boxed Warning for T cell Malignancies Following Treatment with BCMA-Directed or CD19-Directed Autologous Chimeric Antigen Receptor (CAR) T cell Immunotherapies [EB/OL]. 2024-04-18 [2024-10-24].
[4] FDA. Cellular, Tissue, and Gene Therapies Advisory Committee Meeting [EB/OL]. 2022-06-09 [2024-10-24]. https://www.fda.gov/media/159011/download
[5] 李振東,鐘振鵬,董風晴,等.細胞與基因治療產品評價中的基因組整合位點檢測與分析[J].中國臨床藥理學雜志,2025,41(07):1013-1019.
