中文
藥物研發(fā)通常面臨成本高、周期長(zhǎng)、效率低下等挑戰(zhàn)，其原因包括對(duì)疾病機(jī)制缺乏了解、治療靶點(diǎn)有限、以及藥物反應(yīng)的異質(zhì)性等。
單細(xì)胞測(cè)序（Single-cell RNA Sequencing, scRNA-seq）是一種在單個(gè)細(xì)胞水平上檢測(cè)基因表達(dá)的高通量測(cè)序技術(shù)。相比傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，scRNA-seq能夠揭示細(xì)胞異質(zhì)性、識(shí)別稀有細(xì)胞亞群、解析細(xì)胞發(fā)育、免疫微環(huán)境等精細(xì)調(diào)控機(jī)制。其核心步驟包括單細(xì)胞分離、RNA捕獲、逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增、文庫(kù)構(gòu)建和高通量測(cè)序等，結(jié)合生物信息學(xué)分析，可構(gòu)建細(xì)胞圖譜并探索細(xì)胞狀態(tài)與功能。
自2009年問(wèn)世以來(lái)，單細(xì)胞測(cè)序已取得巨大進(jìn)展，且已廣泛應(yīng)用于制藥行業(yè)。通過(guò)將單細(xì)胞測(cè)序分析平臺(tái)與復(fù)雜的計(jì)算方法相結(jié)合，推動(dòng)了疾病生物學(xué)和藥理學(xué)知識(shí)的逐步完善[1]。單細(xì)胞測(cè)序不僅能夠鑒定新的細(xì)胞類(lèi)型和亞型、追蹤細(xì)胞分化軌跡、解析多細(xì)胞器官或腫瘤細(xì)胞組成等，還能夠識(shí)別疾病相關(guān)分子途徑，從而用于預(yù)測(cè)患者生存、評(píng)估治療反應(yīng)、解析耐藥機(jī)制和提供替代治療方案等。
PART 01
單細(xì)胞測(cè)序在藥物開(kāi)發(fā)領(lǐng)域的應(yīng)用
傳統(tǒng)的藥物研發(fā)往往依賴于大規(guī)模細(xì)胞群體的分析，但這一方法難以觸及細(xì)胞層面的信息。單細(xì)胞測(cè)序使研究人員能夠深入探索每個(gè)細(xì)胞的基因表達(dá)譜，并揭示細(xì)胞之間的異質(zhì)性。在藥物開(kāi)發(fā)過(guò)程中，單細(xì)胞測(cè)序可助力靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)、藥物篩選、藥效機(jī)制研究和藥效響應(yīng)預(yù)測(cè)等環(huán)節(jié)。
靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)
獲得高質(zhì)量的治療新靶點(diǎn)是現(xiàn)代藥物研發(fā)的關(guān)鍵。單細(xì)胞測(cè)序可以評(píng)估腫瘤的整體異質(zhì)性和腫瘤微環(huán)境特征，從而更精準(zhǔn)地鎖定藥物靶點(diǎn)。
Abdelfattah et al.[2]在單細(xì)胞水平上對(duì)來(lái)自人類(lèi)膠質(zhì)瘤樣本的200,000個(gè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行綜合分析后，鑒定出9種骨髓細(xì)胞亞型。其中，巨噬細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）具有免疫抑制作用，與患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)。為了找到免疫調(diào)節(jié)的關(guān)鍵靶點(diǎn)，研究人員將注意力轉(zhuǎn)移到免疫抑制性T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中激活的分子。他們發(fā)現(xiàn)，S100A4調(diào)節(jié)蛋白是由膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和骨髓來(lái)源的抑制性細(xì)胞產(chǎn)生和分泌的，其高表達(dá)與預(yù)后變差密切相關(guān)，抑制該基因可改善預(yù)后。因此，S100A4被確認(rèn)為膠質(zhì)瘤的潛在治療靶點(diǎn)。
此外，單細(xì)胞時(shí)間序列分析能夠捕捉靶點(diǎn)在疾病進(jìn)展中的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，通過(guò)追蹤特定細(xì)胞狀態(tài)下的基因表達(dá)和蛋白修飾，可揭示靶點(diǎn)在腫瘤微環(huán)境中的時(shí)間依賴性。Li et al.[3]使用單細(xì)胞測(cè)序?qū)Ψ蜗侔┗蚬こ绦∈竽Ｐ椭蠺regs分布的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行縱向分析（誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后第5/8/12/20周分別取樣）。結(jié)果顯示，干擾素IFN響應(yīng)性Tregs（IF_TR）在腫瘤發(fā)展早期（第5/8周）占比較高，而Klrg1 +Areg + 效應(yīng)Tregs（KA_TR））在疾病晚期（疾病進(jìn)展，第12/20周）占主導(dǎo)地位。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)， KA_TR相關(guān)IL-33受體ST2基因在疾病進(jìn)展時(shí)異常表達(dá)，刪除ST2基因則改變效應(yīng)Tregs的克隆演化，減輕腫瘤負(fù)擔(dān)。因此，研究認(rèn)為KA_TR增殖導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展，其中ST2在腫瘤免疫抑制中起著關(guān)鍵作用，可作為治療干預(yù)的潛在靶點(diǎn)。
藥物發(fā)現(xiàn)和優(yōu)化
抗體藥物是以抗體為核心成分的生物制劑，主要用于癌癥、自身免疫疾病及器官移植抗排斥治療，但其開(kāi)發(fā)周期較長(zhǎng)。 單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)能夠大大縮短抗體篩選時(shí)間，是加速抗體藥物研發(fā)的一把利刃。新冠肺炎疫情期間，研究人員利用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)，從康復(fù)期患者的抗原富集 B 細(xì)胞中快速鑒定出新冠病毒中和抗體，并在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證明了該中和抗體的治療和預(yù)防功效[4]。
此外，研究人員采用類(lèi)似尋找抗體的技術(shù)，通過(guò)對(duì)單個(gè) T細(xì)胞受體的測(cè)序（TCR測(cè)序）可以快速獲得高質(zhì)量的抗原特異的TCR序列，為腫瘤新抗原的開(kāi)發(fā)和個(gè)性化治療提供了新的機(jī)會(huì)。He et al.[5]通過(guò)單細(xì)胞RNA測(cè)序、TCR測(cè)序和體外新抗原刺激，對(duì)腫瘤及其鄰近組織中的T細(xì)胞進(jìn)行了全面表征，發(fā)現(xiàn)用腫瘤抗原特異性 T（Tas）TCR 改造的TCR-T細(xì)胞是一種很有前途的個(gè)體化免疫治療藥物，腫瘤內(nèi)Tas細(xì)胞水平?jīng)Q定了對(duì)免疫治療的反應(yīng)程度。
藥效機(jī)制
單細(xì)胞測(cè)序可以通過(guò)對(duì)組織內(nèi)部每個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組的解析，結(jié)合患者疾病分期、分子分型、藥效學(xué)反應(yīng)和副反應(yīng)等，更好的闡明藥物作用機(jī)制。
Zhao et al.[6]從不同處理小鼠模型中收集大腦組織進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序，根據(jù)不同細(xì)胞類(lèi)型的經(jīng)典標(biāo)記物，鑒定出少突膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞等不同類(lèi)型細(xì)胞，并對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行了亞型分析，將其分為4個(gè)細(xì)胞亞群。大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞中的促炎小膠質(zhì)細(xì)胞亞群MG3和MG4的比例增加，經(jīng)活性氧響應(yīng)聚芬戈莫德納米前藥（NRNs）處理后，MG3和MG4的比例下調(diào)，抗炎亞群MG2的比例增加。這些結(jié)果表明，MCAO小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞亞群出現(xiàn)促炎表型，加重神經(jīng)炎癥，而NRNs治療可促進(jìn)促炎小膠質(zhì)細(xì)胞向抗炎亞群表型轉(zhuǎn)化，有效抑制腦卒中后炎癥反應(yīng)，從而促進(jìn)缺血性腦卒中后受損中樞神經(jīng)系統(tǒng)的恢復(fù)。
藥效預(yù)測(cè)與精準(zhǔn)醫(yī)療
通過(guò)比較藥物處理前后的單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)，可以識(shí)別藥物相關(guān)的差異表達(dá)基因、受激活/抑制的細(xì)胞亞群或者信號(hào)通路。結(jié)合藥效學(xué)和安全性數(shù)據(jù)，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)有助于發(fā)現(xiàn)藥效相關(guān)的預(yù)測(cè)指標(biāo)。
Chasen et al.[7]對(duì)24例LBCL患者的CAR-T細(xì)胞注射液（Infusion Products, IP）進(jìn)行了單細(xì)胞測(cè)序，結(jié)果顯示，與部分緩解或疾病進(jìn)展患者相比，完全緩解患者的IP中記憶性CD8+ T細(xì)胞占比高出3倍。回輸?shù)?天，cfDNA測(cè)序結(jié)果與臨床反應(yīng)顯著相關(guān)（p=0.008）， 而耗竭性CD8+ T細(xì)胞與不良分子反應(yīng)相關(guān)（q=2.8×10?149）。因此，CAR – T個(gè)性化定制IP在細(xì)胞和分子水平上存在異質(zhì)性，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)能夠解析這種差異，有助于預(yù)測(cè)和監(jiān)控細(xì)胞治療療效和毒性，尤其是第7天的分子反應(yīng)和耗竭性CD8+ T細(xì)胞基因表達(dá)可以作為CAR-T細(xì)胞療效的早期預(yù)測(cè)指標(biāo)。
免疫治療在腫瘤治療中占有重要地位，但乳腺癌患者的受益仍有限，因此需要篩選對(duì)免疫治療敏感的生物標(biāo)志物，擴(kuò)大受益患者的群體。Sun et al.[8]采集了28例激素受體陽(yáng)性、既往接受納布紫杉醇+帕博利珠單抗聯(lián)合治療的乳腺癌外周血樣本，通過(guò)單細(xì)胞測(cè)序分析79284個(gè)外周血PBMC細(xì)胞，以在外周血中篩選療效預(yù)測(cè)靶標(biāo)。結(jié)果顯示，治療有效患者中，GZMB+殺傷性CD8+ T細(xì)胞在聯(lián)合治療后顯著擴(kuò)增，并伴隨TCR克隆快速擴(kuò)增；而無(wú)效患者則表現(xiàn)為T(mén)細(xì)胞耗竭且治療后TCR克隆多樣性無(wú)變化。研究提示，通過(guò)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組/TCR測(cè)序聯(lián)合分析，可為開(kāi)發(fā)外周血?jiǎng)討B(tài)監(jiān)測(cè)工具提供新方向?。
PART 02
精翰單細(xì)胞測(cè)序平臺(tái)
精翰生物依托北京尋因生物 SeekOne? DD 單細(xì)胞生成平臺(tái)，構(gòu)建了覆蓋樣本處理、建庫(kù)測(cè)序與生信分析的全流程解決方案。精翰單細(xì)胞測(cè)序平臺(tái)在單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與免疫組庫(kù)測(cè)序領(lǐng)域已成功支持多項(xiàng)申辦方的臨床前/臨床試驗(yàn)項(xiàng)目，為藥物生物標(biāo)志物探索提供有力支持。
? 樣本預(yù)處理：專(zhuān)業(yè)團(tuán)隊(duì)優(yōu)化組織解離、細(xì)胞分選技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞的高效捕獲；單樣本一次可處理500-20000個(gè)細(xì)胞； ? 建庫(kù)測(cè)序：依托 SeekOne? DD 平臺(tái)完成單細(xì)胞包裹與 cDNA 擴(kuò)增，搭配 Illumina/Hiseq 高通量測(cè)序儀或者華大DNBSEQ-T7測(cè)序平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組及免疫組庫(kù)的雙維度解析； ? 生信分析：自主研發(fā)數(shù)據(jù)分析 pipeline，同時(shí)處理單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（scRNA-seq）與單細(xì)胞免疫組庫(kù)測(cè)序（scTCR/BCR-seq）數(shù)據(jù)，涵蓋數(shù)據(jù)質(zhì)控與批次效應(yīng)校正、細(xì)胞聚類(lèi)與細(xì)胞類(lèi)型人工注釋、軌跡推斷、免疫受體克隆型鑒定與克隆多樣性分析、轉(zhuǎn)錄組-免疫組庫(kù)聯(lián)合挖掘等 核心分析模塊； ? 報(bào)告交付：提供個(gè)性化定制報(bào)告，含 UMAP 細(xì)胞分群圖、細(xì)胞比例變化圖、擬時(shí)序分化樹(shù)、RNA流、免疫細(xì)胞亞型分析、免疫克隆型熱圖、V(D)J Circos 圖等專(zhuān)業(yè)圖表，支持個(gè)性化結(jié)果解讀。
PART 03
選擇精翰生物的四大理由
參考文獻(xiàn)：
[1] Van de Sande B, Lee JS, Mutasa-Gottgens E, et al. Applications of single-cell RNA sequencing in drug discovery and development. Nat Rev Drug Discov. 2023;22(6):496-520. doi:10.1038/s41573-023-00688-4
[2] Abdelfattah N, Kumar P, Wang C, et al. Single-cell analysis of human glioma and immune cells identifies S100A4 as an immunotherapy target. Nat Commun. 2022;13(1). doi:10.1038/s41467-022-28372-y
[3] Li A, Herbst RH, Canner D, et al. IL-33 Signaling Alters Regulatory T Cell Diversity in Support of Tumor Development. Cell Rep. 2019;29(10):2998-3008.e8. doi:10.1016/j.celrep.2019.10.120
[4] 李倩, 韋薇. 單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在藥物開(kāi)發(fā)過(guò)程中的應(yīng)用. 中國(guó)新藥雜志. 2023;32(2):154-158.
[5] He J, Xiong X, Yang H, et al. Defined tumor antigen-specific T cells potentiate personalized TCR-T cell therapy and prediction of immunotherapy response. Cell Res. 2022;32(6):530-542. doi:10.1038/s41422-022-00627-9
[6] Zhao Y, Li Q, Niu J, et al. Neutrophil Membrane-Camouflaged Polyprodrug Nanomedicine for Inflammation Suppression in Ischemic Stroke Therapy. Adv Mater. 2024;36(21):e2311803. doi:10.1002/adma.202311803
[7] Chasen B, Dai E, Dang M, et al. Characteristics of anti-CD19 CAR T cell infusion products associated with efficacy and toxicity in patients with large B cell lymphomas. 2021;26(12):1878-1887. doi:10.1038/s41591-020-1061-7.Characteristics
[8] Sun X, Axelrod ML, Waks AG, et al. Dynamic single-cell systemic immune responses in immunotherapy-treated early-stage HR+ breast cancer patients. npj Breast Cancer. 2025;11(1). doi:10.1038/s41523-025-00776-1
