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在藥物研發(fā)進(jìn)程中，藥代動(dòng)力學(xué)（PK）生物分析方法的變更或轉(zhuǎn)移是常見情況。根據(jù)國際人用藥品注冊(cè)技術(shù)協(xié)調(diào)會(huì)（ICH M10）指南，當(dāng)出現(xiàn)以下情況時(shí)必須進(jìn)行交叉驗(yàn)證："a) 在同一研究中采用不同充分驗(yàn)證的方法獲得數(shù)據(jù)；b) 在同一研究中采用相同生物分析方法在不同實(shí)驗(yàn)室獲得數(shù)據(jù)；c) 在不同研究中采用不同充分驗(yàn)證方法獲得的數(shù)據(jù)將被合并或比較，用以支持特殊給藥方案，或關(guān)于安全性、有效性和標(biāo)簽的監(jiān)管決策"。
ICH M10推薦使用Bland-Altman圖進(jìn)行方法間的一致性評(píng)估。該方法通過將兩種測量結(jié)果的差異與其均值進(jìn)行可視化分析，為評(píng)估方法間一致性提供了直觀依據(jù)。在此分析框架下，當(dāng)缺乏公認(rèn)參考方法時(shí)，兩次測量結(jié)果的平均值被視為真實(shí)值的最佳估計(jì)。 基于此前提，該圖的核心價(jià)值在于能夠有效識(shí)別系統(tǒng)偏差，特別是判斷差異是否隨待測物濃度水平的變化而呈現(xiàn)某種趨勢，即檢測濃度依賴性偏差的存在。
然而，盡管ICH M10推薦使用Bland-Altman圖進(jìn)行評(píng)估，卻并未明確給出用于判定兩種方法是否等效的具體統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)，這為實(shí)際工作中的決策帶來了不確定性。針對(duì)上述問題，我們調(diào)研了現(xiàn)有文獻(xiàn)與行業(yè)實(shí)踐，并將在下文中總結(jié)基于Bland-Altman圖的交叉驗(yàn)證一致性標(biāo)準(zhǔn)，以期為業(yè)界同仁提供參考。
PART 01
Bland-Altman圖
圖1 Y軸為差值的B-A圖
X軸：表示兩種方法測量結(jié)果的平均值 (A+B)/2，作為待測物真實(shí)值的最佳估計(jì)。
Y軸：表示兩種方法測量結(jié)果的差異 (A-B)，或百分比差異 (A-B)/Mean × 100%。
圖2 Y軸為百分比差值的B-A圖
在Bland-Altman分析中，縱坐標(biāo)的設(shè)定直接影響對(duì)方法間一致性的解讀。通常，縱坐標(biāo)有兩種表達(dá)方式：絕對(duì)差值（A-B）與百分比差值[(A-B)/Mean×100%]。這兩種表達(dá)方式在圖形解讀上具有本質(zhì)區(qū)別：
當(dāng)采用絕對(duì)差值時(shí)，圖形反映的是方法間差異的絕對(duì)量級(jí)。此時(shí)繪制的一致性界限為固定數(shù)值范圍（如±2.5 μg/mL），適用于評(píng)估差異是否在全濃度范圍內(nèi)保持恒定。然而，在生物分析常見的寬濃度范圍場景中，這種表達(dá)可能產(chǎn)生誤導(dǎo)——低濃度時(shí)相同的絕對(duì)差異可能代表顯著誤差，而高濃度時(shí)則顯得微不足道。
相比之下，百分比差值將差異表示為相對(duì)量，其一致性界限為相對(duì)范圍（如±30%）。這種表達(dá)更符合生物分析方法驗(yàn)證中基于百分比的標(biāo)準(zhǔn)，能夠消除濃度絕對(duì)值對(duì)差異解讀的影響。當(dāng)方法間存在比例性誤差時(shí)，百分比差值的分布將呈現(xiàn)隨機(jī)分布模式；若此時(shí)仍觀察到明顯趨勢，則提示存在需要深入研究的非比例性系統(tǒng)誤差。
在生物分析交叉驗(yàn)證實(shí)踐中，由于待測物濃度常跨越數(shù)個(gè)數(shù)量級(jí)，且方法性能標(biāo)準(zhǔn)通常以相對(duì)誤差定義，采用百分比差值作為縱坐標(biāo)更能提供符合專業(yè)認(rèn)知的一致性評(píng)估。
PART 02
Bland-Altman圖一致性標(biāo)準(zhǔn)
基因泰克（Genentech）在其發(fā)表的交叉驗(yàn)證研究文章中，明確提出了一套與樣本量相適應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)框架。該框架包含一個(gè)主要標(biāo)準(zhǔn)及一項(xiàng)依樣本量動(dòng)態(tài)調(diào)整的次要標(biāo)準(zhǔn)，為交叉驗(yàn)證中的方法一致性評(píng)價(jià)提供了清晰且可操作的規(guī)范。
主要標(biāo)準(zhǔn)（適用于所有樣本量）：
兩種方法的一致性判斷必須滿足：全部樣本濃度百分比差值均值的90%置信區(qū)間完全落在±30%范圍內(nèi)。無論總樣本量多少，此主要標(biāo)準(zhǔn)均為必須達(dá)成的先決條件。
次要根據(jù)（針對(duì)濃度依賴性偏倚）：
若斜率的90%置信區(qū)間包含0：認(rèn)為不存在濃度依賴性偏倚；
若斜率的90%置信區(qū)間不包含0：需進(jìn)行亞組分析；
樣本量≥約70：進(jìn)行四分位分析（Q1、Q2&3、Q4）。若所有亞組的90%置信區(qū)間均在±30%內(nèi)，則認(rèn)為無濃度依賴性偏倚；
樣本量約40-50：將樣本分為兩個(gè)濃度亞組（高低各半）。若兩個(gè)亞組的90%置信區(qū)間均在±30%內(nèi)，則認(rèn)為無濃度依賴性偏倚；
樣本量≤30：不建議進(jìn)行亞組分析。應(yīng)依賴主要標(biāo)準(zhǔn)并結(jié)合Bland-Altman圖的直觀觀察進(jìn)行評(píng)估。
PART 03
交叉驗(yàn)證一致性標(biāo)準(zhǔn)的設(shè)立依據(jù)
交叉驗(yàn)證中所采用的一致性標(biāo)準(zhǔn)，其設(shè)定主要參考了行業(yè)通行實(shí)踐與統(tǒng)計(jì)學(xué)的通用原則。具體來看，±30%判定閾值的設(shè)置，主要借鑒了實(shí)際樣本再分析（ISR）中常用的接受標(biāo)準(zhǔn)。該閾值為兩個(gè)在不同實(shí)驗(yàn)室或平臺(tái)中均經(jīng)過完整驗(yàn)證的方法之間的比較，設(shè)定了可接受的偏差范圍。
在置信區(qū)間的選擇方面，90%置信水平的設(shè)定參考了生物等效性研究中的常見做法。該置信水平在行業(yè)中被廣泛用于評(píng)價(jià)方法間的一致性，采用這一標(biāo)準(zhǔn)有助于使本次方法比較的評(píng)估過程與業(yè)界常用統(tǒng)計(jì)規(guī)范保持一致，從而增強(qiáng)結(jié)果的可比性。
PART 04
案例
在明確了交叉驗(yàn)證的科學(xué)標(biāo)準(zhǔn)后，讓我們通過一個(gè)真實(shí)案例來看看這套標(biāo)準(zhǔn)如何落地。基因泰克在推進(jìn)抗TIGIT抗體tiragolumab的全球臨床研究時(shí)，就面臨一個(gè)關(guān)鍵問題：同一檢測方法在不同實(shí)驗(yàn)室能否產(chǎn)生一致可信的數(shù)據(jù)？他們用完整的驗(yàn)證過程給出了答案。
實(shí)驗(yàn)對(duì)象與樣本
研究采用了100份來自全球臨床試驗(yàn)的人血清實(shí)際研究樣本為分析對(duì)象。樣本選擇采用分層抽樣策略，覆蓋6 μg/mL至252 μg/mL的預(yù)期濃度范圍，并按濃度四分位數(shù)進(jìn)行不等量抽樣，其中最低濃度區(qū)間（Q1）和最高濃度區(qū)間（Q4）各抽取30份樣本，中間濃度區(qū)間（Q2與Q3）共抽取40份樣本，以確保在全濃度范圍內(nèi)均具有充分的代表性。
分析方法
研究采用酶聯(lián)免疫吸附分析法對(duì)tiragolumab進(jìn)行定量分析。該方法以TIGIT為靶點(diǎn)，使用生物素標(biāo)記的TIGIT作為捕獲試劑，地高辛標(biāo)記的TIGIT作為檢測試劑，通過夾心ELISA原理實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的特異性檢測。
統(tǒng)計(jì)方法
統(tǒng)計(jì)分析采用基于Bland-Altman分析的交叉驗(yàn)證策略。主要評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為全部樣本百分比差值均值的90%置信區(qū)間需完全落在±30%范圍內(nèi)。輔助分析包括繪制百分比差值與濃度均值的Bland-Altman散點(diǎn)圖，以及計(jì)算百分比差值與濃度均值回歸斜率的90%置信區(qū)間。若斜率置信區(qū)間不包含0，則進(jìn)一步進(jìn)行濃度四分位亞組分析。
核心結(jié)果
統(tǒng)計(jì)分析顯示，100個(gè)樣本的百分比差值均值為-3.82%，其90%置信區(qū)間為[-5.89%, -1.76%]，完全滿足預(yù)設(shè)的±30%等效性標(biāo)準(zhǔn)。回歸斜率的90%置信區(qū)間[-0.00005, 0.00003]包含0，表明不存在濃度依賴性偏倚。Bland-Altman圖顯示雖有2個(gè)樣本的百分比差異超出±30%，但未呈現(xiàn)明顯的濃度依賴趨勢。綜上，該ELISA方法在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室間具有良好的一致性，可用于同一臨床試驗(yàn)中不同實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)的合并與分析。
圖3 兩個(gè)不同實(shí)驗(yàn)室使用相同生物分析方法的Bland-Altman百分比差異圖
注：百分比差值計(jì)算公式：（（實(shí)驗(yàn)室B濃度 - 實(shí)驗(yàn)室A濃度）/（實(shí)驗(yàn)室A濃度與實(shí)驗(yàn)室B濃度的平均值））× 100%
表1 兩個(gè)不同實(shí)驗(yàn)室使用相同生物分析方法的百分比差異及斜率統(tǒng)計(jì)分析
在現(xiàn)有監(jiān)管框架下，常規(guī)生物分析交叉驗(yàn)證的樣本量通常需達(dá)到監(jiān)管指南建議的30例及以上，這使得基于總體樣本的主要標(biāo)準(zhǔn)（90%置信區(qū)間落在±30%內(nèi)）成為實(shí)踐中應(yīng)用最廣泛的判斷依據(jù)。然而，如本研究所呈現(xiàn)，當(dāng)樣本量充足時(shí)（如n=100），通過斜率分析與濃度四分位評(píng)估的次要標(biāo)準(zhǔn)能夠有效識(shí)別潛在的濃度依賴性偏倚，為方法可比性提供更深層次的科學(xué)依據(jù)。對(duì)這部分內(nèi)容感興趣的讀者，可進(jìn)一步參閱原文中案例二的詳細(xì)討論。
PART 05
熙寧|精翰免疫分析平臺(tái)
基于ICH M10推薦的交叉驗(yàn)證策略，熙寧生物|精翰生物免疫分析平臺(tái)在生物分析方法比對(duì)與轉(zhuǎn)移方面擁有豐富項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)，并已建立起完善的技術(shù)服務(wù)體系。我們依托自身技術(shù)優(yōu)勢，配備專業(yè)統(tǒng)計(jì)能力，為客戶提供符合監(jiān)管要求的整合統(tǒng)計(jì)分析方法的交叉驗(yàn)證服務(wù)。該體系已在多個(gè)實(shí)際項(xiàng)目中成功應(yīng)用，能夠確保交叉驗(yàn)證研究既滿足監(jiān)管要求，又具備充分的科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)性。
參考文獻(xiàn)：
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