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隨著新藥研發的靶點越來越新，創新藥研發從Fast Follow到First in Class, Best in 、Class大步調邁進，新興靶點的藥物實體在臨床早期是否能夠看到有效性的信號是需要迫切回答的問題，也是藥物研發企業決定該藥是否進入臨床Ⅱ期進行風險控制的重要決策因素。國家藥品監督管理局藥品審評中心密集發布《模型引導的藥物研發技術指導原則》，《以患者為中心的臨床試驗設計技術指導原則》，《以臨床價值為導向的抗腫瘤藥物臨床研發指導原則》等指導性文件，這也要求新藥研發企業在臨床早期提供藥物有效性相關的數據來支撐新藥進入ⅡⅢ期臨床，保護臨床受試者的權益，提高臨床公共醫療資源配置效率。在臨床Ⅰ期進行藥物藥理藥效生物標志物檢測是回答上述問題，來滿足監管需求的最佳技術解決路徑。本文將藥效學生物標志物的臨床應用，生物分析內容和策略，以及臨床生物分析案例對藥效生物標志物的臨床檢測進行闡述。
美國的NIH對藥效生物標志物有一個非常恰當的定義1，翻譯下來如下：
藥效學(PD)生物標志物是藥物作用于生物體內靶點的效應分子指標。PD生物標志物可用于檢驗臨床給藥方案、靶標效應和腫瘤生理學響應之間的聯系。在新藥開發階段重點PD生物標志物測量可提供關鍵數據，以做出明智的、早期的繼續/不繼續決策，選擇合理的靶向藥物組合，并優化聯合藥物方案等。鑒于藥效需學生物標志物在靶向治療藥物研發中的關鍵作用，經過驗證和可靠的臨床PD檢測方法是必要的。
藥效生物標志物大致主要有兩種臨床應用：
一、早期研究中尚無法確定與臨床結果最相關的藥效學生物標志物時，可將多個藥效學生物標志物以及藥代動力學特征相結合，為R2PD劑量選擇提供重要依據。例如，在布魯頓氏酪氨酸激酶（BTK）抑制劑的開發過程中，BTK靶點占有率，可作為選擇臨床推薦劑量和給藥方式的重要依據2。在模型引導的藥物研發（MIDD）中，藥效學生物標志物是建模和分析的核心因素。
二、用與臨床結局建立明確相關性的藥效學生物標志物作為替代終點，縮短研發周期，使有效的藥物更早惠及患者。比如生存期延長是腫瘤藥物研發中反映臨床獲益的金標準，因此在抗腫瘤藥物臨床試驗中，通常采用反映生存獲益的指標總生存時間（OS）或被證實與OS相關的替代終點（如無進展生存時間）作為主要終點支持監管決策。采用上述終點時，往往研究周期較長。
在創新藥物臨床研發前沿，多采用藥效生物標志物結果，結合藥代動力學特征數據，用于R2PD劑量選擇或者跟監管機構進行溝通，可作為藥物有效性的重要依據。基于臨床Ⅰ期的藥效生物標志物數據進行Ⅱ期臨床決策，是對Ⅰ期看安全性和最大藥物耐受，Ⅱ期看有效性等教科書式刻板印象的挑戰，也是藥物從化療藥物到靶向藥物迭代的智慧選擇。
從生物分析臨床實踐角度，藥效生物標志物以待檢測標志物是否能夠拿到合適的標準品物質可分為兩類：定量型生物標志物和非定量型生物標志物。定量型和非定量型藥效生物標志物的方法學開發難度，方法學開發和驗證內容有著較大的差異，需要區別進行對待。
定量型藥效生物標志物的分析策略：
定量型藥效生物標志物通常能夠通過蛋白重組技術在體外表達標準品物質，基于標準品物質的標準曲線對臨床樣品的生物標志物在檢測體系中的信號值進行濃度的回算預測，通常臨床檢測樣品為血清、血漿，腦脊液等液體基質，采用ELISA/MSD等LBA方法進行檢測。定量型藥效生物標志物的方法學開發和驗證過程大體可參考抗體藥物PK檢測的技術路徑如《ICH M10：生物分析方法驗證及樣品分析》，需要進行精密度，準確度，靈敏度，稀釋線性等方法學驗證。但也有一些區別，關鍵點在于需要在方法學開發和驗證階段，考察檢驗檢測體系中標準物質和樣品的待測物質是否有了類似的劑量曲線，需要進行平行性和選擇性檢驗，如圖1。平行性和選擇性檢驗內容可參考筆者寫的另一篇文章3，在此不做詳述。
圖1. 定量型生物標志物平行性和選擇性驗證內容
非定量型藥效生物標志物的分析策略：
非定量型藥效生物標志物通常拿不到標準品物質，需要基于檢測的信號值進行藥效生物標志物的強度表征，存在較大的批間差異。該類型的藥效標志物臨床樣品通常為人體腫瘤組織或者全血PBMC等，采用IHC，流式，LBA，細胞學等方法進行檢測。非定量型藥效生物標志物檢測方法多樣，通常為用藥前后細胞胞內或者胞外膜蛋白表達豐度，受體占位，胞內磷酸化蛋白，甲基化蛋白等指標的變化情況作為檢測對象，具備功能學檢測特征。如下圖2。某合成致死抑制劑存在的幾種臨床藥效生物標志檢測方式，以及優劣如下：
圖2. 非定量型生物標志物臨床檢測路徑
在制定藥效學生物標志物檢測方案前，需要對定量型藥效生物標志物和非定量型生物標志物進行合理區分。非定量型生物標志物檢測多為功能學檢測，其方法具有難度較大，檢測技術路徑不明確，模式不固定，樣品穩定性較差等特點，因此需要較長的方法學開發周期和強大的方法學開發技術能力，在臨床樣品分析階段如果方法學開發和驗證沒有做好，很可能會出現藥物濃度和藥效學生物標志物變化不明顯，甚至反轉的情形，風險較大。
非定量型藥效生物標志物方法學開發難度較大，因此需要基于藥物作用機理，生物標志物生理學特征，臨床樣品可及性，以及方法學參數性能等多方面進行考量，從而制定合適的分析策略。
部分示例如下：
基于血漿基質的PIA檢測方法
采用刺激劑A和B刺激Jurkat的細胞系，檢測不同的藥效生物標志物的刺激效果和方法學信號窗口，選擇合適的檢測體系。基于血漿中藥物在檢測體系中和藥效生物標志物的藥效相關性選擇合適的刺激劑，生物標志物等實驗條件進行臨床樣品的藥效生物標志物分析。
基于PBMC基質的流式檢測方法
基于全血PBMC的免疫分型，以及藥物在特定細胞亞群中翻譯后修飾蛋白的藥效相關性建立流式檢測體系。采用特定細胞亞群的檢測方法相對于采用PBMC裂解MSD檢測方法，有更佳的信號窗口，方法學穩固性以及藥效相關性。
基于PBMC裂解液的ELISA方法
采用PAR標準物質，腫瘤細胞系，PBMC，全血PBMC逐層推進的方法優選出合適的針對全血樣品裂解液中PAR（poly ADP-ribose）的特異性抗體對，以及建立藥物和PAR（poly ADP-ribose）的藥效相關性性檢測體系，有優于試劑盒的性能。
基于腫瘤組織的IHC方法
采用篩選的γH2AX特異性抗體，進行用藥前后腫瘤組織的γH2AX免疫組化染色，建立藥物用藥劑量和γH2AX的藥效相關性。
基于血清基質的抗體藥物ADCC功能
構建NUGC4 luciferase單克隆細胞系，優化PBMC和NUGC4 luciferase單克隆E:T比，建立穩固的基于血清樣品的抗體藥物介導的ADCC功能檢測體系，檢測窗口可達50倍，方法學穩固。
藥效學生物標志物的臨床生物分析策略需要基于藥物作用機理，生物標志物生理學特征，臨床樣品可及性和穩定性，以及方法學參數性能等多方面進行考量，制定不同的分析策略。熙寧生物|精翰生物由多位博士組成的轉化醫學團隊可進行特定藥效學方法的方案設計與評估，目前也已有完備的功能學檢測方法庫，可進行臨床藥效相關性模型的搭建和藥效生物標志物的篩選探索工作，可優化組合最適宜的方法學條件和藥效標志物，確保臨床藥效生物標志物檢測的方法學性能。
熙寧生物|精翰生物有齊全的技術平臺和專業化的團隊專注于臨床藥理藥效學生物分析領域，對于預期難度較高的檢測項目可同時進行多技術平臺（IHC，流式，LBA和qPCR等）的方法學開發，優選檢測方法進行方法學驗證。目前已積累了豐富的臨床階段藥效學實戰經驗，包括100+定量藥效生物標志物和50+非定量藥效生物標志物方法學開發，驗證和樣品分析，可基于臨床采集運輸前處理檢測的全生命周期流程進行方法學開發和驗證，，歡迎咨詢交流。
參考文獻：
[1].https://next.cancer.gov/developmentresources/pd_biomarker.htm
[2].Bilal Tariq, Ying C. Ou, Jennifer C. Stern, Vaibhav Mundra, Nicole Wong Doo, Patricia Walker, Katharine L. Lewis, Chester Lin, William Novotny, Srikumar Sahasranaman, Stephen Opat. (2023) A phase 1, open-label, randomized drug–drug interaction study of zanubrutinib with moderate or strong CYP3A inhibitors in patients with B-cell malignancies. Leukemia & Lymphoma 64:2, pages 329-338.
[3].生物標志物方法質量和方法驗證參數關聯的深度解析（1）
