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新冠的爆發(fā)讓mRNA技術(shù)從各種疫苗技術(shù)中脫穎而出，也推動(dòng)了mRNA疫苗的商業(yè)化，輝瑞/BioNTech以及Moderna的兩款mRNA疫苗的相繼獲批上市，mRNA疫苗未來將會(huì)有更廣闊的發(fā)展空間。隨著越來越多的mRNA疫苗應(yīng)用于臨床，疫苗的有效性和安全性評(píng)價(jià)也更加需要重視。
01
mRNA疫苗作用機(jī)制
mRNA疫苗將特異性抗原的部分mRNA引入人體細(xì)胞內(nèi)，利用宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成機(jī)制產(chǎn)生抗原，從而激發(fā)特異性免疫反應(yīng)，并達(dá)到形成免疫記憶的效果。mRNA疫苗可分為預(yù)防性傳染病mRNA疫苗和治療性腫瘤mRNA疫苗。預(yù)防性傳染病mRNA疫苗在細(xì)胞中表達(dá)傳染病特異抗原，激活機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)產(chǎn)生抗體，從而達(dá)到預(yù)防傳染性疾病的目的。治療性腫瘤mRNA疫苗是在機(jī)體細(xì)胞內(nèi)合成腫瘤特異性抗原蛋白，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，從而有針對(duì)性地攻擊腫瘤細(xì)胞，達(dá)到腫瘤預(yù)防或治療的作用。
圖1 mRNA疫苗作用機(jī)制
如圖所示，mRNA疫苗從合成到啟動(dòng)免疫反應(yīng)主要經(jīng)歷以下三個(gè)階段，包括體外mRNA合成、細(xì)胞內(nèi)加工和啟動(dòng)免疫反應(yīng)。mRNA疫苗被封裝在脂質(zhì)體（LNP）載體納米顆粒中，并被抗原呈遞細(xì)胞內(nèi)吞，mRNA從載體逃逸后釋放到細(xì)胞質(zhì)中，然后由核糖體翻譯成抗原蛋白。隨后，內(nèi)源性抗原被蛋白酶體降解為多肽，由MHC I呈遞并激活細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CD8+T細(xì)胞）。此外，分泌的抗原可被細(xì)胞吸收，在內(nèi)切體內(nèi)降解，并通過MHC II類蛋白在細(xì)胞表面呈現(xiàn)給輔助性T細(xì)胞。最后，輔助性T細(xì)胞（CD4+T細(xì)胞）刺激B細(xì)胞產(chǎn)生抗病原體的中和抗體。
02
mRNA疫苗優(yōu)勢(shì)
· 有效性高：一次給藥，可表達(dá)多種抗原，免疫原性強(qiáng)，可激活細(xì)胞免疫和體液免疫；
· 安全性高：不存在潛在宿主感染風(fēng)險(xiǎn)或整合到宿主細(xì)胞基因組中的誘變風(fēng)險(xiǎn)，自我降解可通過正常生理過程代謝；
· 研發(fā)周期短：平臺(tái)技術(shù)復(fù)用性強(qiáng)，能更有效應(yīng)對(duì)突發(fā)疫情或病毒變異；
· 低生產(chǎn)成本+快生產(chǎn)速度：體外轉(zhuǎn)錄合成制備，無需細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物源基質(zhì)，生產(chǎn)線可復(fù)用可快速制備。通常傳統(tǒng)疫苗的生產(chǎn)至少需要6個(gè)月時(shí)間，而mRNA疫苗由于高產(chǎn)量的體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和快速制劑的特點(diǎn)，在實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)的情況下30天內(nèi)就可產(chǎn)成，疫苗的時(shí)效性在應(yīng)對(duì)突發(fā)疫情尤其是病毒變異時(shí)分外重要。
03
mRNA疫苗應(yīng)用
mRNA技術(shù)在理論上可以生產(chǎn)出任何一種人類所需的蛋白質(zhì)。除新冠疫苗外，mRNA疫苗廣泛應(yīng)用于傳染病預(yù)防研究，如預(yù)防呼吸道合胞病毒（RSV）、巨細(xì)胞病毒（CMV）、寨卡病毒、流感病毒、狂犬病毒等傳染性疾病領(lǐng)域。Moderna宣布RSV mRNA疫苗mRNA-1345的三期臨床達(dá)到主要終點(diǎn)，對(duì)于2種或2種以上癥狀的保護(hù)率為83.7%，mRNA-1345為表達(dá)pre-F蛋白的單價(jià)mRNA疫苗，進(jìn)行單次免疫，根據(jù)該數(shù)據(jù)，Moderna將于2023年遞交上市申請(qǐng)。
mRNA疫苗能夠更精準(zhǔn)地靶向特異免疫目標(biāo)。篩選出腫瘤相關(guān)抗原進(jìn)行測(cè)序、分析，將對(duì)應(yīng)的mRNA序列合成疫苗，使自身細(xì)胞生產(chǎn)出抗原標(biāo)識(shí)物，并以此激發(fā)對(duì)應(yīng)的特異性免疫。由于mRNA疫苗中的編碼可以進(jìn)行編輯，可以準(zhǔn)確地控制產(chǎn)生的抗原蛋白種類和序列，選擇僅僅在腫瘤細(xì)胞中才會(huì)分泌的抗原蛋白標(biāo)志物作為靶點(diǎn)，避免誤傷其他正常細(xì)胞，使特異免疫精準(zhǔn)地靶向腫瘤。此外，mRNA 疫苗能夠激發(fā)針對(duì)細(xì)胞的T細(xì)胞免疫，在殺傷腫瘤細(xì)胞方面擁有更高的效率。
mRNA-4157（個(gè)體化腫瘤疫苗）是針對(duì)每位腫瘤患者量身定制的個(gè)體化腫瘤疫苗，能夠容納高達(dá)34個(gè)編碼新抗原的mRNA序列，注射到患者體內(nèi)后，mRNA上攜帶的指令就會(huì)告訴患者的癌細(xì)胞表達(dá)所選的新表位，進(jìn)而患者自身的免疫系統(tǒng)能夠識(shí)別出癌細(xì)胞并精準(zhǔn)的殺傷腫瘤細(xì)胞。Merck與Moderna聯(lián)合開發(fā)的個(gè)體化癌癥疫苗mRNA-4157正與Merck的PD-1抗體（Keytruda）聯(lián)用，應(yīng)用于完全切除的黑色素瘤患者的輔助治療。臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，與單獨(dú)使用Keytruda相比，聯(lián)合治療將復(fù)發(fā)或死亡的風(fēng)險(xiǎn)降低了44%， FDA 已授予“突破性治療”認(rèn)定，用于高危黑色素瘤患者接受完全切除術(shù)后的輔助治療，此次認(rèn)定意味著mRNA療法可能成為治療黑色素瘤和其他癌癥的新興前沿療法。
04
mRNA疫苗的免疫原性評(píng)估
圖2 疫苗研發(fā)中涉及的不同類型的生物分析方法
免疫原性是疫苗研發(fā)各個(gè)階段需要關(guān)注的重要指標(biāo)，包括疫苗的免疫原性評(píng)價(jià)以及有效性評(píng)價(jià)。以輝瑞/BioNTech新冠mRNA疫苗為例，COVID-19 mRNA疫苗的有效性和安全性分析如下：
· ELISA/Luminex檢測(cè)血清中抗體針對(duì)COVID-19病毒Spike蛋白及RBD區(qū)域的結(jié)合作用；
· 疫苗誘導(dǎo)的中和抗體應(yīng)答通過COVID-19病毒中和試驗(yàn)和假病毒中和試驗(yàn)檢測(cè)；
· IFN-γ ELISPOT檢測(cè)PBMC的免疫響應(yīng)（使用Spike重組糖蛋白分別刺激疫苗接種前后同一志愿者體內(nèi)PBMC，對(duì)比接種后和接種前細(xì)胞分泌IFN-γ程度）；
· 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+ T cell及CD8+ T cell經(jīng)Spike重組糖蛋白刺激后產(chǎn)生的IL-2、IFN-γ及TNFα；
· MSD/Luminex驗(yàn)證細(xì)胞因子檢測(cè)；
圖3 mRNA疫苗臨床生物分析內(nèi)容
（以輝瑞/BioNTech新冠mRNA疫苗為例）
圖4 四種新冠疫苗誘導(dǎo)的體液和細(xì)胞免疫
圖5 BNT162b2誘導(dǎo)IgG抗體和病毒中和抗體
結(jié)合抗體和中和抗體常用于mRNA疫苗的免疫原性和保護(hù)效力分析，BNT162b2疫苗1/2期臨床試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)BNT162b2產(chǎn)生了強(qiáng)烈新冠抗體反應(yīng)，SARS-CoV-2人體血清中有50%的中和幾何平均滴度（GMT）是COVID-19人群恢復(fù)期樣本（HCS）中觀察到的3.3倍。BNT162b2誘導(dǎo)血清中和了22種含有SARS-CoV-2S變體的假病毒。
圖6 BNT162b2誘導(dǎo)T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子
細(xì)胞免疫的作用機(jī)制主要是包括兩個(gè)方面，致敏T細(xì)胞的直接殺傷作用，以及其通過釋放細(xì)胞因子的協(xié)同作用，因此mRNA疫苗細(xì)胞免疫分析為細(xì)胞免疫表型及胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)、監(jiān)測(cè)疫苗接種后的安全性，通常采用流式細(xì)胞術(shù)（FACS）或酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（ELISPOT）來進(jìn)行檢測(cè)。
BNT162b2臨床試驗(yàn)中，大多數(shù)參與者具有強(qiáng)烈的IFNγ或IL-2陽性CD8+和CD4+T細(xì)胞反應(yīng)，并在9周后的整個(gè)觀察期內(nèi)仍能檢測(cè)到。一周后，表位特異性CD8+早期分化的效應(yīng)器記憶表型T細(xì)胞占總循環(huán)CD8+的0.02-2.92%，8周后檢測(cè)到0.01-0.28%。總之，BNT162b2在人體內(nèi)可誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體以及多特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)。
05
總結(jié)與經(jīng)驗(yàn)
熙寧生物|精翰生物擁有完善的技術(shù)平臺(tái)和豐富的經(jīng)驗(yàn)，可為mRNA疫苗臨床前以及臨床階段提供一站式的生物分析服務(wù)。包括mRNA基因水平檢測(cè)（qPCR），表達(dá)產(chǎn)物水平和功能活性檢測(cè)（Bioassay/ELISA/MSD），抗病毒結(jié)合抗體和抗病毒中和抗體檢測(cè)（Cell Based Assay/LBA），細(xì)胞免疫反應(yīng)（ELISPOT/FACS）以及細(xì)胞因子（ELISA/MSD/Luminex）等，高效助力mRNA藥物研發(fā)。
熙寧生物 免疫分析平臺(tái)介紹
支持產(chǎn)品類型：
蛋白藥（單抗，雙抗，融合蛋白，ADC，融合蛋白等），細(xì)胞和基因治療藥物
可檢測(cè)項(xiàng)目：
藥代動(dòng)力學(xué)(PK)，藥效學(xué)(PD)
抗藥抗體(ADA)，中和抗體(NAb)
生物標(biāo)志物(Biomarker)，細(xì)胞因子
熙寧生物 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞亞群經(jīng)驗(yàn)
? 檢測(cè)CD45、CD3、CD4、CD8、CD19，CD56等指標(biāo) (TBMNK)
? 檢測(cè)CD3、CD4、CD8、CD19、CD56、CD25、CD127等指標(biāo) (TBNK, Treg)
? 檢測(cè)CD3、CD4、CD8、CD16、CD56，Ki67等指標(biāo) (Ki67)
? 檢測(cè)CD3、CD4、CD8、中心記憶細(xì)胞、效應(yīng)記憶細(xì)胞( CD45RA, CCR7)
? 檢測(cè)CD3、CD4、CD8、PD-1、LAG3、TIM3、 中心記憶細(xì)胞、效應(yīng)記憶細(xì)胞
? 檢測(cè)CD3、CD4、CD8、Treg、NK、 Ki67等指標(biāo) （細(xì)胞增殖）
? 檢測(cè)CD3、CD4、CD8、CD25、CD69、HLA-DR (T細(xì)胞激活）
? 檢測(cè)CD3、CD4、CD8、4-1BB、ICOS (T細(xì)胞激活）
? 檢測(cè)BCMA、CD19 、CD38、CD138、CD56、CD117
? 檢測(cè)骨髓克隆性漿細(xì)胞含量（CD45、CD19、D38、CD56、CD138）
? 檢測(cè)淋巴細(xì)胞亞群分型（CD19 、CD22 、CD38、CD138、CD56、CD117）
? 檢測(cè)淋巴細(xì)胞亞群分型（BCMA、CD19 、CD38、CD138、CD56、CD117）
? 檢測(cè)CD45、CD38、CD138、CD19、CD117、CD81、BCMA、Kappa、Lambda、CD56、CD27
? 檢測(cè)CD19、CD45、CD38、CD56、CD20、CD138、CD269、k輕鏈、λ輕鏈
? 檢測(cè) CD45、CD3、CD4、CD8、CD19、CD56、CD25、CD127、CD45RA、CCR7、PD-1、TIGIT、TIM3、LAG3、CD27、CD69、CD38、HLR-DR、4-1BB
06
參考文獻(xiàn)
1. mRNA-based modalities for infectious disease management
2. 2020 White Paper on Recent Issues in Bioanalysis: Vaccine Assay Validation, qPCR Assay Validation, QC for CAR-T Flow Cytometry, NAb Assay Harmonization and ELISpot.
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4. Development of functionally relevant potency assays for monovalent and multivalent vaccines delivered by evolving technologies
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