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疫苗研發是一個復雜而漫長的過程。免疫原性是疫苗研發各個階段（從臨床前疫苗候選物的免疫原性評價到臨床研究及上市后研究）及疫苗有效性評價時需要關注的重要指標之一。疫苗大多是通過刺激機體產生特異性抗體而發揮其預防作用。
以mRNA疫苗為例，mRNA疫苗的核心作用機理是將mRNA序列導入到宿主細胞的細胞質，利用宿主細胞將mRNA翻譯為蛋白抗原，最終介導機體產生抗原特異性免疫應答，并形成免疫記憶。在抗原特異性免疫應答過程中，B淋巴細胞特異性活化，產生抗原特異性抗體，介導體液免疫應答。同時，輔助T細胞（CD4+）以及殺傷性T細胞（CD8+）活化，分泌細胞因子，活化B淋巴細胞，發揮細胞毒作用，介導細胞免疫應答 [1]。相較于傳統的滅活疫苗或者亞單位疫苗，mRNA編碼的抗原可以在機體內較為持久地產生，介導較為持續且強烈的免疫應答，具有明顯的免疫保護力優勢。
圖1 疫苗誘導的體液免疫和細胞免疫反應 [2]
PART 01
細胞免疫
細胞免疫指T細胞介導的免疫應答，即T細胞受到抗原刺激后，分化、增殖、轉化為致敏T細胞（也稱效應T細胞），當相同抗原再次進入機體的細胞中時，致敏T細胞對抗原的直接殺傷作用及致敏T細胞所釋放的細胞因子的協同殺傷作用。T細胞的免疫特性不僅決定了疫苗保護性的細胞免疫，也決定著體液免疫的誘導，與持久免疫和誘導廣泛中和抗體相關的疫苗的功效。
傳統的T 細胞在表型和功能上具有多樣性，并且在抗病毒持久保護中發揮著關鍵作用。根據T細胞表面受體和功能不同，分為輔助性T細胞（CD4+ T淋巴細胞）、細胞毒性T細胞（CD8+ T淋巴細胞）和抑制性T細胞。CD8+ T細胞直接攻擊和殺死病毒感染細胞，而CD4+ T細胞則是啟動CD8+ T細胞和B 細胞的關鍵細胞。呼吸道中的CD8+毒性T 淋巴細胞（CTL）通過直接殺死受感染的細胞來抑制病毒復制，并分泌包括干擾素γ（IFN-γ）和腫瘤壞死因子（TNF-α） 在內的抗病毒細胞因子。CD4+ T輔助細胞則具有多種調節抗病毒免疫的關鍵功能，肺中的記憶 CD4+ T 細胞通過Th1細胞因子（白細胞介素-2、干擾素γ、腫瘤壞死因子等）依賴性等機制控制早期病毒的復制。
此外，T細胞耗竭和功能障礙是誘導疫苗細胞免疫的重要影響因素。例如，在新冠患者中大多表現出淋巴細胞減少的癥狀，其中優先影響T細胞群，淋巴細胞減少和T細胞衰竭可能是新冠患者臨床惡化的主要原因之一，而T細胞介導的炎癥反應也可能是導致重癥患者繼發性并發癥的主要因素。
更高的安全性、更長效的持久免疫、誘導更廣泛的中和抗體以及誘導細胞介導的免疫應答是疫苗開發的當前趨勢。越來越多的研究表明特異性的細胞免疫應答在疫苗的預防以及保護階段起著非常重要的作用。
圖2 疫苗誘導的細胞免疫應答 [3]
PART 02
細胞免疫原性在疫苗研究中的應用
2.1 細胞免疫原性在新冠研究中的應用
針對新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）的中和抗體可以免受病毒的侵害或發揮強有力的保護作用，然而，大約30%的患者體內幾乎不存在新冠病毒中和抗體，這表明有其他免疫機制參與了病毒康復清除。除此之外，與特異性抗體短效性相比，新冠特異性CD8+ T細胞相對持久且保持穩定，在感染12個月后仍被檢測到，這也進一步表明T細胞在對抗新冠病毒的免疫記憶中的重要性，并且可能介導長期的抗病毒保護 [4-6]。
圖3 T 細胞對新冠病毒的免疫反應 [7]
不同人群中新冠病毒特異性T細胞免疫反應也有所不同 [8]。有研究通過分析2019冠狀病毒病COVID-19患者、COVID-19康復患者、未暴露群體和疫苗接種人群的新冠病毒特異性T細胞應答及新型冠狀病毒T細胞免疫的人群特征，大量的研究發現體液免疫和細胞免疫均參與了人體對SARS-CoV-2的保護和清除，SARS-CoV-2可以引起COVID-19 患者T細胞應答， T細胞活化程度與疾病嚴重程度密切相關，大多數急性期重癥患者中可檢測到SARS-CoV-2特異性抗體反應，部分患者可能存在抗體延遲反應，而所有重癥患者的細胞反應在急性期均受損，且COVID-19康復患者體內存在記憶T細胞，能對外來的新冠抗原產生免疫應答。COVID-19特異性抗體反應和細胞免疫反應在康復患者可維持較長時間，重癥患者的免疫應答顯著強于輕癥患者 [9-11] 。
通過干擾素-γ的酶聯免疫斑點（ELISPOT）、細胞內細胞因子染色（ICS）或激活誘導標記（AIM）等病毒特異性T 細胞應答的激活驗證，病毒特異性T細胞免疫反應強烈偏向于Th1細胞因子（IFN-γ、TNF-α 和IL-2），及很少的Th2細胞因子（IL-4 和IL-6）。此外，部分未暴露健康人群的T細胞也能被COVID-19抗原激活，預示了交叉反應和預存免疫的存在，疫苗接種人群體內存在特異性記憶淋巴細胞從而抵御新冠病毒入侵 [12]。
圖4 CD4+T和CD8+T細胞在新冠感染后保持12個月的記憶性細胞應答 [13]
2.2 細胞免疫原性在水痘-帶狀皰疹病毒疫苗研究
帶狀皰疹是一種常見的病毒感染性疾病，嚴重影響患者特別是老年患者的生活質量。帶狀皰疹是由初次感染后潛伏在脊髓后根神經節或顱內神經節內的水痘?帶狀皰疹病毒（varicella?zoster virus，VZV）再激活引發的一種常見的感染性疾病，主要影響老年人群，發生帶狀皰疹后神經痛是最重要的并發癥，其疾病負擔重，生活質量影響大 [14]。
VZV初次感染后數天或數周內可在血清中檢測到特異性IgM、IgG和IgA以及VZV特異性T細胞介導的免疫應答（VZV cell?mediated immune，VZV?CMI）。其中特異性抗體水平可維持終生，能有效預防水痘再次發生，而VZV?CMI對控制VZV細胞內感染、維持VZV潛伏狀態并預防帶狀皰疹發生至關重要。老齡化、疾病或使用免疫抑制劑等因素，可導致VZV?CMI水平下降，并成為帶狀皰疹發生的重要條件。研究證實，發生帶狀皰疹后預防復發主要依靠再次升高的VZV?CMI水平而不依賴特異性抗體。免疫功能低下的帶狀皰疹患者由于不能有效形成并維持較高水平的VZV?CMI，是疾病復發的重要基礎。
接種疫苗提升人體VZV?CMI水平是預防和降低發生帶狀皰疹的主要機制，這在健康人及疾病狀態下均得到證實。帶狀皰疹疫苗可提高VZV?CMI和體液免疫兩個方面的應答水平，前者很可能是阻止VZV再激活以達到預防帶狀皰疹的主要機制，但體液免疫可通過抗體依賴細胞毒效應等途徑發揮一定的作用 [15]。
Shingrix是葛蘭素史克公司研發生產的含佐劑的重組帶狀皰疹疫苗（recombinant zoster vaccine， RZV），包含50 μg VZV糖蛋白E（glycoprotein E，gE）和AS01B佐劑系統。其中gE是VZV衣殼的主要成分，是激發VZV特異性抗體和T細胞應答的主要靶抗原。AS01B可導致注射部位肌肉和引流淋巴結中先天性免疫應答的快速而短暫激活，進而使活化的抗原呈遞細胞數量增加，促進產生高水平的gE 特異性CD4+T細胞和抗體。臨床試驗結果顯示Shingrix疫苗的整體有效性為97.2%，在50~59歲人群中保護率為96.6%，對60~69歲的人群保護率為97.4%，而在≥70歲人群中保護率也能達到97.9% [16] 。
VZV特異性抗體及VZV?CMI是評價帶狀皰疹疫苗免疫原性的兩個重要指標。在細胞免疫應答評價中，胞內因子染色分析2種及以上細胞因子（IFN-γ，IL-2，TNF-α，CD40L）的VZV特異性CD4+ T細胞水平，顯示gE/AS01B誘導出較高的VZV特異性CD4+ T細胞水平，但未能誘導出CD8+ T細胞。長達10年隨訪研究發現，體液免疫水平是接種前的6.0倍，細胞免疫水平是接種前的3.5倍，此外，相關的數學模型也預測疫苗相關免疫應答在首次疫苗接種后可維持至少20年 [17-18] 。
圖5 胞內細胞因子因子染色分析Shingrix疫苗免疫后2種及以上細胞因子的VZV特異性CD4+ T細胞水平 [17-18]
圖6 Shingrix疫苗免后10年隨訪研究的體液免疫和細胞免疫水平變化 [17-18]
2.3 細胞免疫原性在腫瘤治療性疫苗研究中的應用
腫瘤治療性疫苗是指通過誘導或增強機體針對腫瘤抗原的特異性主動免疫反應，從而達到控制和殺傷腫瘤細胞、清除微小殘留病灶以及建立持久的抗腫瘤記憶等治療目的的一類產品，包括但不限于細胞載體疫苗、病毒載體疫苗、蛋白/多肽疫苗、核酸（DNA或RNA）疫苗等類型。
大多數腫瘤治療性疫苗的作用機制是通過抗原呈遞細胞（APC）將抗原加工并呈遞給T細胞，從而誘導產生或放大已存在的抗原特異性T細胞反應，尤其是細胞毒性T細胞反應，以攻擊腫瘤細胞。此外，T細胞還可以輔助B細胞產生特異性抗體殺傷腫瘤細胞。
圖7 mRNA-4157可以激活腫瘤新生抗原的特異性T細胞，誘導新生抗原特異性CD8+ T細胞的增殖 [19]
Moderna mRNA-4157為一種個性化腫瘤疫苗，靶向患者的特異性突變，編碼最多至34種新生抗原，這些新抗原是根據每位患者腫瘤獨特的DNA序列突變特征設計而成。當將此癌癥疫苗注射入體內時，這些RNA所攜帶的新抗原序列會被翻譯成蛋白質，并通過體內的抗原呈遞，刺激產生T細胞抗腫瘤反應。臨床研究結果表明，mRNA-4157可以激活腫瘤新生抗原的特異性T細胞，誘導新生抗原特異性CD8+ T細胞的增殖，進而殺傷腫瘤細胞。同時，mRNA-4157與Keytruda聯用可加強T細胞介導的對腫瘤細胞的破壞，可以顯著降低III、IV期黑色素瘤患者在腫瘤完全切除后的復發或死亡風險。目前，Moderna公司和默沙東宣布，首個mRNA個性化癌癥疫苗mRNA-4157和抗PD-1單抗（Keytruda）組合療法推進到了3期臨床試驗，這也是全球首個進入3期臨床試驗的mRNA癌癥疫苗。
2.4 細胞免疫原性在新佐劑研究中的應用
佐劑（Adjuvant）作為一類添加在疫苗中的免疫調節劑，相比只使用抗原，當其先于抗原或與抗原混合注入機體后，能極大增強疫苗的免疫應答水平或者改變免疫反應的類型。佐劑最主要的作用是促進機體產生針對抗原特異性的體液與細胞免疫，涉及到抗原遞呈細胞對抗原的攝取、抗原的處理以及抗原的遞呈等方面。抗原遞呈細胞又稱輔佐細胞，是機體內具有攝取、處理和傳遞抗原信息，誘發T細胞和 B細胞發生免疫應答作用的細胞，主要包括巨噬細胞、樹突狀細胞和B細胞等。
佐劑增強免疫應答的機制尚未完全闡明，不同佐劑的作用也各有不同。最主要的作用是促進機體產生針對抗原特異性的體液與細胞免疫，涉及到抗原提呈細胞對抗原的攝取、抗原的處理以及抗原的提呈等方面，且多佐劑效應也不能通過單一機理進行解釋。
PART 03
結 語
熙寧生物|精翰生物具備完善的細胞免疫研究（ELISPOT和ICS）解決方案和數據匯報體系，自主開發的全血穩定劑可解決疫苗細胞免疫研究臨床運營痛點，在大樣本項目的管理方面擁有豐富的經驗，可提供完善的中心實驗室服務。
與此同時，熙寧生物|精翰生物具有豐富的疫苗研究和抗傳染病領域研究經驗，具有完備的生物分析服務平臺，支持臨床和臨床前研究，可實現基于配體結合實驗的結合抗體檢測，基于活病毒或報告基因的中和抗體檢測，基于ELISPOT和ICS的細胞免疫檢測，以及基于PCR的病毒分型和載量的檢測，覆蓋呼吸道合胞病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、人乳頭瘤病毒、流感病毒、破傷風毒素、乙肝病毒和治療性腫瘤疫苗等研究領域。未來，熙寧生物|精翰生物仍將根據臨床試驗需求繼續開發更加準確、靈敏、快捷以及解決臨床運營痛點的檢測方法和解決方案，助力疫苗和抗傳染病領域臨床研究。
參考文獻:
[1] Immunological mechanisms of vaccine-induced protection against COVID-19 in humans.
[2] A guide to vaccinology from basic principles to new developments.
[3] Cell-mediated immunity and the challenges for vaccine development.
[4] Reduction and functional exhaustion of T cells in patients with coronavirus disease 2019 (COVID-19).
[5] Deep immune profiling of COVID-19 patients reveals distinct immunotypes with therapeutic implications.
[6] Recruitment of highly cytotoxic CD8+ T cell receptors in mild SARS-CoV-2 infection.
[7] 新型冠狀病毒T細胞免疫的人群特征.
[8] Virus-specific memory CD8 T cells provide substantial protection from lethal severe acute respiratory syndrome coronavirus infection.
[9] T-cell responses and therapies against SARS-CoV-2 infection.
[10] Targets of T cell responses to SARS-CoV-2 coronavirus in humans with COVID-19 disease and unexposed individuals.
[11] SARS-CoV-2-derived peptides define heterologous and COVID-19-induced T cell recognition.
[12] Robust T cell Immunity in convalescent individuals with asymptomatic or mild COVID-19.
[13] The T cell immune response against SARS-CoV-2.
[14] Immune Responses to Varicella-Zoster Virus Vaccines.
[15] 水痘-帶狀皰疹病毒的病原學及其相關疫苗的研究進展.
[16] Immune Responses to a Recombinant Glycoprotein E Herpes Zoster Vaccine in Adults Aged 50 Years or Older.
[17] Immunogenicity of the Adjuvanted Recombinant Zoster Vaccine Persistence and Anamnestic Response to Additional Doses Administered 10 Years After Primary Vaccination.
[18] Long-term Protection Against Herpes Zoster by the Adjuvanted Recombinant Zoster Vaccine Interim Efficacy, Immunogenicity, and Safety Results up to 10 Years After Initial Vaccination.
[19] https://www.modernatx.com.
[20] Validation of Cell-Based Assays in the GLP Setting-VALIDATION OF THE IFN-γ ELISPOT ASSAY
